血清氨基酸在炎癥性腸病中的診斷效能評價

童天穎，張 潔，徐潤灝，王震華△

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院：1.消化科；2.檢驗科，上海 200120)

炎癥性腸病(IBD)包括克羅恩病(CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(UC)兩種主要類型，是一種引起胃腸道炎性反應(yīng)的慢性特發(fā)性疾病[1]，在過去的幾十年間，其在亞洲的發(fā)病率日益增加，成為影響全球健康的疾病負擔[2]。IBD的病因及發(fā)病機制目前仍不明確，其診斷依賴于內(nèi)鏡、組織病理學(xué)和影像學(xué)等檢查[3-4]，但由于上述檢查手段存在侵入性及成本高等缺點，在IBD患者臨床篩查及常規(guī)監(jiān)測中仍存在限制性，為臨床醫(yī)生迅速診斷IBD患者帶來困難。因此，非侵入性的、經(jīng)濟可靠的生物標志物是IBD輔助診斷的重要手段。代謝組學(xué)是近年來迅速發(fā)展的一種新技術(shù)，用于檢測、鑒定和量化特定環(huán)境下生物體代謝的低相對分子質(zhì)量代謝物。代謝途徑異常與IBD密切相關(guān)，是IBD發(fā)生和發(fā)展中的關(guān)鍵事件，被認為是IBD的特征性改變之一[5]，其中氨基酸代謝在調(diào)節(jié)腸道健康的途徑中發(fā)揮重要作用，參與蛋白質(zhì)合成、基因表達、氧化應(yīng)激及免疫調(diào)節(jié)等過程[6-10]。本研究回顧性分析了223例IBD患者與125例健康體檢者10項血清氨基酸水平的差異，并結(jié)合二元Logistic回歸分析結(jié)果，建立回歸模型，進而探究該模型在IBD中的診斷效能，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2016年8月至2019年1月本院收治的經(jīng)內(nèi)鏡檢查、組織病理學(xué)及影像學(xué)確診的IBD患者共223例作為IBD組，包括153例CD患者(CD組)和70例UC患者(UC組)；其中男150例，女73例；平均年齡(35.45±13.64)歲。根據(jù)蒙特利爾分型[11]，CD組患者病變部位包括回腸末段67例，結(jié)腸22例，回結(jié)腸64例；CD組中病變部位無狹窄及穿透患者86例，發(fā)生病變部位狹窄患者67例，發(fā)生病變部位穿透患者0例，發(fā)生肛瘺病變93例；UC組患者病變范圍包括直腸3例，左半結(jié)腸31例，廣泛結(jié)腸36例。選擇同期于本院進行健康體檢者125例納入健康對照(HC)組，內(nèi)鏡檢查及影像學(xué)檢查結(jié)果均未見異常，其中男71例，女54例；平均年齡(49.18±11.70)歲。

1.2儀器與試劑 使用主要儀器包括API3200MD三重四級桿質(zhì)譜儀(美國ABSciex公司)、Shimadzu系列液相色譜儀(日本島津公司)、Hitachi7600全自動生化分析儀(日本日立公司)；使用主要試劑包括氨基酸代謝譜分析試劑盒(上海可力梅塔生物醫(yī)藥科技有限公司)、甲醇(HPLC級，MERCK公司)。

1.3方法 樣品處理：采用含促凝劑真空采血管采集所有研究對象空腹靜脈血4 mL，3 000 r/min離心10 min，分離血清。取10 μL待測標本、氨基酸低值質(zhì)控品RQCL及氨基酸高值質(zhì)控品RQCH于EP管中，分別加入40 μL氨基酸標本稀釋液，振蕩混勻，2 000 r/min 離心5 min。設(shè)置氮吹儀溫度50 ℃，吹干；加入復(fù)融液100 μL至96孔板內(nèi)，以600 r/min離心5 min。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法：色譜條件如下，分析柱為XbridgeC18(3.0×50 mm，3.5 μm，美國waters公司)，流動相A為水，流動相B為甲醇，梯度洗脫，總分析時間為13 min，流速為0.5 mL/min，進樣量為8 μL。質(zhì)譜條件如下，電噴霧離子源，負離子掃描，霧化氣壓力為40 psi,輔助加熱器壓力為60 psi,氣簾氣壓力為20 psi，碰撞氣壓力為6 psi，離子源電壓為-4 500 V，離子源溫度為600 ℃；MRM掃描分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。呈非正態(tài)分布的計量資料以M(P25,P75)表示，多組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。采用二元Logistic回歸建立合適的診斷模型。采用受試者工作特征(ROC)曲線進行診斷效能評價。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組10項血清氨基酸指標比較 與HC組比較，IBD組甘氨酸(Gly)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、脯氨酸(Pro)、鳥氨酸(Orn)和谷氨酸(Glu)水平明顯升高，而精氨酸(Arg)和酪氨酸(Tyr)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組丙氨酸(Ala)和瓜氨酸(Cit) 水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與HC組相比，UC組Arg水平明顯降低，CD組Val和Glu水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。僅有5項血清氨基酸(Gly、Tyr、Leu、Pro、Orn)變化在IBD組及其不同亞型中均出現(xiàn)明顯改變(P<0.05),見表1。

表1 各組10 項血清氨基酸指標比較[M(P25,P75),nmol/L]

組別nAlaProCitOrnGluHC組125486.28(423.73,570.79)189.93(159.80,219.94)30.94(23.79,36.63)129.77(104.70,150.29)238.58(188.93,276.90)IBD組223478.11(385.99,608.79)219.72(181.27,273.23)30.24(23.81,38.80)171.13(127.23,274.98)257.34(199.39,323.08)CD組153469.51(381.39,608.73)222.85(184.30,281.60)30.05(24.08,38.41)190.76(132.62,307.23)260.93(206.88,328.82)UC組70483.58(388.79,618.83)209.40(171.73,264.98)31.83(23.11,40.83)158.37(114.86,198.78)255.16(183.26,303.56)PIBD vs. HC0.664<0.0010.598<0.0010.002PCD vs. HC0.570<0.0010.779<0.0010.001PUC vs. HC0.9750.0200.448<0.0010.161PCD vs. UC0.7220.1340.6380.0010.202

2.2ROC曲線分析5項候選氨基酸及回歸模型在IBD中的潛在診斷價值 采用ROC曲線進一步分析5項候選氨基酸在IBD患者中的診斷效能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨運用Gly、Tyr、Leu、Pro和Orn作為診斷指標時，未見較好的診斷效能(AUC均<0.80)，見表2。因此，進一步對血清氨基酸及年齡運用二元Logistic回歸進行分析以建立合適的診斷模型。納入Logistic回歸模型的參數(shù)選擇標準如下：(1)在IBD組與HC組、CD組與HC組、UC組與HC組中均出現(xiàn)明顯變化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；(2)在二元Logistic回歸分析結(jié)果中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。最終，納入了Gly、Tyr、Leu、Pro和Orn 5項候選氨基酸并建立回歸模型，ROC曲線分析顯示，采用回歸模型明顯提高了單個氨基酸在IBD中的診斷效能，AUC為0.908(95%CI:0.873～0.936)，靈敏度和特異度分別為87.44%、81.60%。見表2。

表2 ROC曲線分析5項候選血清氨基酸及回歸模型在IBD中的潛在診斷價值

3 討 論

代謝異常為IBD的特征性改變之一，血液通常被認為是代謝物庫，血液中的代謝物可能是IBD發(fā)生、發(fā)展過程中的代表性生物標志物[5]。最近的代謝組學(xué)研究顯示氨基酸代謝可能與IBD的發(fā)病機制相關(guān)[12]。

氨基酸幾乎是所有類型細胞的基本代謝物質(zhì)，在維持腸道健康中發(fā)揮重要作用，不僅充當腸黏膜細胞中用于蛋白合成的底物，也是參與主要代謝途徑的調(diào)節(jié)劑[8]。在過去的隊列研究中發(fā)現(xiàn)，IBD患者血清及糞便中氨基酸水平異常[10]。KOLHO等[13]發(fā)現(xiàn)在兒童IBD患者中Orn和Pro等代謝物質(zhì)升高；BOSCH等[14]發(fā)現(xiàn)Leu和Val在IBD患者糞便中明顯升高，這也與本研究結(jié)果一致，這可能與IBD患者在炎性反應(yīng)狀態(tài)下蛋白質(zhì)作為分解代謝的能源潛在利用增加相關(guān)。此外，有證據(jù)表明一些氨基酸在緩解腸道炎性反應(yīng)中發(fā)揮作用，例如L-精氨酸，是一氧化氮合成的一種前體，與疾病的炎性反應(yīng)程度呈負相關(guān)[15]。

代謝組學(xué)在闡明疾病機制，以及確定用于診斷和監(jiān)測疾病的生物標志物中存在潛在價值，液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用是最常用的代謝組學(xué)研究方法之一，使代謝相關(guān)的生物標志物在臨床中的運用成為可能。但由于代謝物質(zhì)存在多樣性，且易受外在環(huán)境影響，因此，單個生物標志物在診斷中仍存在局限性。此外，盡管CD和UC在臨床表現(xiàn)中存在相似性，但由于生物學(xué)行為存在差異而導(dǎo)致其氨基酸變化有所不同，因此，篩查IBD患者的臨床潛在生物標志物時尋找在不同亞型中存在共性變化的物質(zhì)更為重要。本研究的回歸模型中納入了5項在IBD組及其亞型中均出現(xiàn)變化的物質(zhì)。該回歸模型在IBD中具有較好的診斷能力，AUC為0.908，靈敏度和特異度分別為87.44%、81.60%。

作為一項探索性研究，本研究僅為代謝譜檢測在臨床診斷中運用的初探，因缺乏前瞻性數(shù)據(jù)，在后續(xù)研究中需進一步完善代謝譜在IBD中的應(yīng)用，對IBD患者的代謝變化進行縱向追蹤。

綜上所述，血清氨基酸水平的改變與IBD關(guān)系密切，且血清氨基酸在作為篩查IBD患者的輔助診斷工具中存在價值。