血清氨基酸在炎癥性腸病中的診斷效能評(píng)價(jià)

童天穎，張 潔，徐潤(rùn)灝，王震華△

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院：1.消化科；2.檢驗(yàn)科，上海 200120)

炎癥性腸病(IBD)包括克羅恩病(CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(UC)兩種主要類(lèi)型，是一種引起胃腸道炎性反應(yīng)的慢性特發(fā)性疾病[1]，在過(guò)去的幾十年間，其在亞洲的發(fā)病率日益增加，成為影響全球健康的疾病負(fù)擔(dān)[2]。IBD的病因及發(fā)病機(jī)制目前仍不明確，其診斷依賴于內(nèi)鏡、組織病理學(xué)和影像學(xué)等檢查[3-4]，但由于上述檢查手段存在侵入性及成本高等缺點(diǎn)，在IBD患者臨床篩查及常規(guī)監(jiān)測(cè)中仍存在限制性，為臨床醫(yī)生迅速診斷IBD患者帶來(lái)困難。因此，非侵入性的、經(jīng)濟(jì)可靠的生物標(biāo)志物是IBD輔助診斷的重要手段。代謝組學(xué)是近年來(lái)迅速發(fā)展的一種新技術(shù)，用于檢測(cè)、鑒定和量化特定環(huán)境下生物體代謝的低相對(duì)分子質(zhì)量代謝物。代謝途徑異常與IBD密切相關(guān)，是IBD發(fā)生和發(fā)展中的關(guān)鍵事件，被認(rèn)為是IBD的特征性改變之一[5]，其中氨基酸代謝在調(diào)節(jié)腸道健康的途徑中發(fā)揮重要作用，參與蛋白質(zhì)合成、基因表達(dá)、氧化應(yīng)激及免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程[6-10]。本研究回顧性分析了223例IBD患者與125例健康體檢者10項(xiàng)血清氨基酸水平的差異，并結(jié)合二元Logistic回歸分析結(jié)果，建立回歸模型，進(jìn)而探究該模型在IBD中的診斷效能，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2016年8月至2019年1月本院收治的經(jīng)內(nèi)鏡檢查、組織病理學(xué)及影像學(xué)確診的IBD患者共223例作為IBD組，包括153例CD患者(CD組)和70例UC患者(UC組)；其中男150例，女73例；平均年齡(35.45±13.64)歲。根據(jù)蒙特利爾分型[11]，CD組患者病變部位包括回腸末段67例，結(jié)腸22例，回結(jié)腸64例；CD組中病變部位無(wú)狹窄及穿透患者86例，發(fā)生病變部位狹窄患者67例，發(fā)生病變部位穿透患者0例，發(fā)生肛瘺病變93例；UC組患者病變范圍包括直腸3例，左半結(jié)腸31例，廣泛結(jié)腸36例。選擇同期于本院進(jìn)行健康體檢者125例納入健康對(duì)照(HC)組，內(nèi)鏡檢查及影像學(xué)檢查結(jié)果均未見(jiàn)異常，其中男71例，女54例；平均年齡(49.18±11.70)歲。

1.2儀器與試劑 使用主要儀器包括API3200MD三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(美國(guó)ABSciex公司)、Shimadzu系列液相色譜儀(日本島津公司)、Hitachi7600全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)；使用主要試劑包括氨基酸代謝譜分析試劑盒(上海可力梅塔生物醫(yī)藥科技有限公司)、甲醇(HPLC級(jí)，MERCK公司)。

1.3方法 樣品處理：采用含促凝劑真空采血管采集所有研究對(duì)象空腹靜脈血4 mL，3 000 r/min離心10 min，分離血清。取10 μL待測(cè)標(biāo)本、氨基酸低值質(zhì)控品RQCL及氨基酸高值質(zhì)控品RQCH于EP管中，分別加入40 μL氨基酸標(biāo)本稀釋液，振蕩混勻，2 000 r/min 離心5 min。設(shè)置氮吹儀溫度50 ℃，吹干；加入復(fù)融液100 μL至96孔板內(nèi)，以600 r/min離心5 min。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法：色譜條件如下，分析柱為XbridgeC18(3.0×50 mm，3.5 μm，美國(guó)waters公司)，流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為甲醇，梯度洗脫，總分析時(shí)間為13 min，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量為8 μL。質(zhì)譜條件如下，電噴霧離子源，負(fù)離子掃描，霧化氣壓力為40 psi,輔助加熱器壓力為60 psi,氣簾氣壓力為20 psi，碰撞氣壓力為6 psi，離子源電壓為-4 500 V，離子源溫度為600 ℃；MRM掃描分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。呈非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25,P75)表示，多組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。采用二元Logistic回歸建立合適的診斷模型。采用受試者工作特征(ROC)曲線進(jìn)行診斷效能評(píng)價(jià)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組10項(xiàng)血清氨基酸指標(biāo)比較 與HC組比較，IBD組甘氨酸(Gly)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、脯氨酸(Pro)、鳥(niǎo)氨酸(Orn)和谷氨酸(Glu)水平明顯升高，而精氨酸(Arg)和酪氨酸(Tyr)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組丙氨酸(Ala)和瓜氨酸(Cit) 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與HC組相比，UC組Arg水平明顯降低，CD組Val和Glu水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。僅有5項(xiàng)血清氨基酸(Gly、Tyr、Leu、Pro、Orn)變化在IBD組及其不同亞型中均出現(xiàn)明顯改變(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 各組10 項(xiàng)血清氨基酸指標(biāo)比較[M(P25,P75),nmol/L]

組別nAlaProCitOrnGluHC組125486.28(423.73,570.79)189.93(159.80,219.94)30.94(23.79,36.63)129.77(104.70,150.29)238.58(188.93,276.90)IBD組223478.11(385.99,608.79)219.72(181.27,273.23)30.24(23.81,38.80)171.13(127.23,274.98)257.34(199.39,323.08)CD組153469.51(381.39,608.73)222.85(184.30,281.60)30.05(24.08,38.41)190.76(132.62,307.23)260.93(206.88,328.82)UC組70483.58(388.79,618.83)209.40(171.73,264.98)31.83(23.11,40.83)158.37(114.86,198.78)255.16(183.26,303.56)PIBD vs. HC0.664<0.0010.598<0.0010.002PCD vs. HC0.570<0.0010.779<0.0010.001PUC vs. HC0.9750.0200.448<0.0010.161PCD vs. UC0.7220.1340.6380.0010.202

2.2ROC曲線分析5項(xiàng)候選氨基酸及回歸模型在IBD中的潛在診斷價(jià)值 采用ROC曲線進(jìn)一步分析5項(xiàng)候選氨基酸在IBD患者中的診斷效能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)運(yùn)用Gly、Tyr、Leu、Pro和Orn作為診斷指標(biāo)時(shí)，未見(jiàn)較好的診斷效能(AUC均<0.80)，見(jiàn)表2。因此，進(jìn)一步對(duì)血清氨基酸及年齡運(yùn)用二元Logistic回歸進(jìn)行分析以建立合適的診斷模型。納入Logistic回歸模型的參數(shù)選擇標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)在IBD組與HC組、CD組與HC組、UC組與HC組中均出現(xiàn)明顯變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(2)在二元Logistic回歸分析結(jié)果中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。最終，納入了Gly、Tyr、Leu、Pro和Orn 5項(xiàng)候選氨基酸并建立回歸模型，ROC曲線分析顯示，采用回歸模型明顯提高了單個(gè)氨基酸在IBD中的診斷效能，AUC為0.908(95%CI:0.873～0.936)，靈敏度和特異度分別為87.44%、81.60%。見(jiàn)表2。

表2 ROC曲線分析5項(xiàng)候選血清氨基酸及回歸模型在IBD中的潛在診斷價(jià)值

3 討 論

代謝異常為IBD的特征性改變之一，血液通常被認(rèn)為是代謝物庫(kù)，血液中的代謝物可能是IBD發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的代表性生物標(biāo)志物[5]。最近的代謝組學(xué)研究顯示氨基酸代謝可能與IBD的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[12]。

氨基酸幾乎是所有類(lèi)型細(xì)胞的基本代謝物質(zhì)，在維持腸道健康中發(fā)揮重要作用，不僅充當(dāng)腸黏膜細(xì)胞中用于蛋白合成的底物，也是參與主要代謝途徑的調(diào)節(jié)劑[8]。在過(guò)去的隊(duì)列研究中發(fā)現(xiàn)，IBD患者血清及糞便中氨基酸水平異常[10]。KOLHO等[13]發(fā)現(xiàn)在兒童IBD患者中Orn和Pro等代謝物質(zhì)升高；BOSCH等[14]發(fā)現(xiàn)Leu和Val在IBD患者糞便中明顯升高，這也與本研究結(jié)果一致，這可能與IBD患者在炎性反應(yīng)狀態(tài)下蛋白質(zhì)作為分解代謝的能源潛在利用增加相關(guān)。此外，有證據(jù)表明一些氨基酸在緩解腸道炎性反應(yīng)中發(fā)揮作用，例如L-精氨酸，是一氧化氮合成的一種前體，與疾病的炎性反應(yīng)程度呈負(fù)相關(guān)[15]。

代謝組學(xué)在闡明疾病機(jī)制，以及確定用于診斷和監(jiān)測(cè)疾病的生物標(biāo)志物中存在潛在價(jià)值，液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用是最常用的代謝組學(xué)研究方法之一，使代謝相關(guān)的生物標(biāo)志物在臨床中的運(yùn)用成為可能。但由于代謝物質(zhì)存在多樣性，且易受外在環(huán)境影響，因此，單個(gè)生物標(biāo)志物在診斷中仍存在局限性。此外，盡管CD和UC在臨床表現(xiàn)中存在相似性，但由于生物學(xué)行為存在差異而導(dǎo)致其氨基酸變化有所不同，因此，篩查IBD患者的臨床潛在生物標(biāo)志物時(shí)尋找在不同亞型中存在共性變化的物質(zhì)更為重要。本研究的回歸模型中納入了5項(xiàng)在IBD組及其亞型中均出現(xiàn)變化的物質(zhì)。該回歸模型在IBD中具有較好的診斷能力，AUC為0.908，靈敏度和特異度分別為87.44%、81.60%。

作為一項(xiàng)探索性研究，本研究?jī)H為代謝譜檢測(cè)在臨床診斷中運(yùn)用的初探，因缺乏前瞻性數(shù)據(jù)，在后續(xù)研究中需進(jìn)一步完善代謝譜在IBD中的應(yīng)用，對(duì)IBD患者的代謝變化進(jìn)行縱向追蹤。

綜上所述，血清氨基酸水平的改變與IBD關(guān)系密切，且血清氨基酸在作為篩查IBD患者的輔助診斷工具中存在價(jià)值。