產ESBLs肺炎克雷伯菌藥敏性和耐藥基因表型分析

鄧明惠，候 軒，張 微，王 輝，辜依海

(西安交通大學醫學院附屬三二〇一醫院檢驗科，陜西漢中 723000)

肺炎克雷伯菌是醫院及社區獲得性感染中臨床分離的最常見病原菌之一[1-2]。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，臨床分離的肺炎克雷伯菌耐藥性也越來越強，肺炎克雷伯菌在人體和外界環境中具有較強的生存能力，這使其成為導致社區獲得性感染的主要病原菌之一[3]。有研究表明，社區獲得性肺炎克雷伯菌感染導致的病死率高于醫院獲得性肺炎克雷伯菌感染導致的病死率，且近年來社區獲得性肺炎克雷伯菌感染患者數量及感染患者的基因類型逐漸增多，患病程度也越來越嚴重[4]，因此，社區獲得性感染也逐漸受到臨床醫生的高度重視。本研究收集本院各臨床科室感染患者送檢的各類標本中分離培養的產超廣譜-β內酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌菌株，檢測其耐藥性及ESBLs的基因表型，比較社區獲得性感染和醫院獲得性感染菌株之間的差異，指導臨床醫生合理使用抗菌藥物，并預防耐藥菌株的傳播。

1 資料與方法

1.1菌株來源 共收集2016年1月至2018年6月95株本院臨床科室送檢標本中分離培養出的產ESBLs肺炎克雷伯菌。因留菌污染等原因，經再次鑒定后，剔除14株菌株，剩余81株產ESBLs肺炎克雷伯菌，其中來自痰液標本56株，血液標本17株，尿液標本4株，分泌物標本3株，腦脊液標本1株。根據患者入院時間將81株產ESBLs肺炎克雷伯菌分為社區獲得性感染及醫院獲得性感染，即患者入院48 h之內采集標本進行培養，并且患者在3個月內未到過醫療機構就診或服用抗菌藥物則劃分為社區獲得性感染，反之則劃分為醫院獲得性感染。

1.2方法

1.2.1菌種鑒定 革蘭染色：用接種環取1滴生理鹽水滴在玻片上，用接種針取MH瓊脂平板上已分純的新鮮菌落，在生理鹽水中涂勻，放烘箱中，待烘干后經酒精燈外焰固定，再進行革蘭染色。加結晶紫液染1 min，用清水沖去染液瀝干；加碘液染1 min，清水沖洗后瀝干；再加脫色液，輕輕搖動10～30 s，至無紫色脫落為止，清水沖洗后瀝干；最后加入復染液，約30 s，清水沖洗后放入烘箱，烘干后鏡檢。

1.2.2留菌判讀依據 肺炎克雷伯菌為革蘭陰性、較短粗的桿菌，大小(0.5～0.8)μm×(1～2)μm，單獨、成雙或短鏈狀排列。無芽孢，無鞭毛，患者標本直接涂片或在營養豐富培養基上可見菌體外有明顯的莢膜，多數有菌毛。在初次分離培養基上可形成較大、凸起、灰白色、黏液菌落。菌落大而厚實、光亮、濕潤，相鄰近菌落易融合，以接種針蘸取時可拉出細絲，在中國藍瓊脂培養基或麥康凱培養基上能發酵乳糖，并產酸，形成黏液型較大的有色菌落。

1.2.3質控菌株 陰性質控菌株大腸埃希菌ATCC25922和陽性質控標準菌株肺炎克雷伯菌ATCC70060均購自陜西省臨床檢驗中心。

1.2.4紙片擴散(K-B)法 對臨床收集并鑒定為肺炎克雷伯菌的菌株采用K-B法進行藥敏試驗，所用藥敏紙片包括氨芐西林、哌拉西林、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、頭孢西丁、慶大霉素、阿米卡星、四環素、環丙沙星、復方磺胺甲噁唑、替加環素、米諾環素、多黏菌素E 21種抗菌藥物，均購自英國OXOID公司。耐藥折點的判讀及產ESBLs確認標準參照2013年美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)標準進行。

1.2.5肺炎克雷伯菌產ESBLs確認試驗 使用到的材料及工具包括配制好的MH瓊脂平板、分純的單克隆菌落、無菌鑷子、無菌生理鹽水、無菌棉簽、抗菌藥物藥敏紙片。將細菌傳種于MH瓊脂平板上，并分區劃線，放入35 ℃恒溫培養箱孵育18～24 h，挑取單克隆菌株，并調制菌懸液至0.5麥氏濁度單位，用無菌棉簽蘸取適量菌液均勻涂布于MH平板上，室溫放置5 min后貼抗菌藥物紙片。將頭孢噻肟(30 μg)、頭孢噻肟/克拉維酸(30/10 μg)、頭孢他啶(30 μg)、頭孢他啶/克拉維酸(30/10 μg)藥敏紙片貼于MH瓊脂平板上，兩紙片間距離為25 mm，然后將貼好的MH瓊脂平板置于35 ℃恒溫培養箱孵育過夜后判讀結果。

1.2.6耐藥基因的檢測 細菌DNA模板的制備：從低溫冰箱中取出保存菌株，用接種環傳種到血瓊脂培養基上，然后快速將菌株放回低溫冰箱，避免菌株反復凍融。在EP管中先加入2 mL雙蒸水，再刮取3～5個已培養18～24 h的新鮮菌落置于EP管中，用移液槍輕輕混勻，置于沸水中煮10 min，再放置于離心機中(4 ℃，12 000 r/min)離心2 min，上清液即為粗提DNA模板，用移液槍吸取上清液至無菌的EP管中，保存于-20 ℃冰箱備用。PCR擴增篩選的耐藥基因包括blaCTX-M-1、blaCTX-M-9、blaTEM、blaSHV，所用引物序列及擴增片段長度見表1，引物均由西安擎科生物有限公司合成。

表1 PCR擴增所用引物序列、擴增片段長度

1.3統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行數據處理及統計分析，計數資料以例數或百分率表示，多組間比較采用χ2檢驗，多組間中的兩組比較采用Fisher確切概率法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1生化鑒定 95株細菌中有81株鑒定為肺炎克雷伯菌，即三糖鐵試驗陽性，蛋白胨水試驗陰性，枸櫞酸試驗陽性，尿素試驗陽性，經API20E鑒定結果符合率為99.8%。

2.2肺炎克雷伯菌藥敏試驗結果 對鑒定為肺炎克雷伯菌的81株菌進行了21種抗菌藥物的藥敏檢測，結果發現這些菌株表現出了較高的耐藥性，見表2。對于氨芐西林耐藥率高達98.8%；但是對含抑制劑藥物耐藥率卻有了明顯的下降，如阿莫西林/克拉維酸(39.5%)、氨芐西林/舒巴坦(63.0%)、哌拉西林/他唑巴坦(2.5%)；對第一、二、三代頭孢菌素藥物的敏感情況也不理想，頭孢呋辛敏感率為11.1%，頭孢噻肟敏感率為3.7%，頭孢他啶也僅有33.3%，而對第四代頭孢菌素頭孢吡肟耐藥率為21.0%；所有菌株均對美羅培南、亞胺培南表現為較敏感，沒有出現對碳青霉烯類藥物耐藥的菌株；對多黏菌素E敏感率為100.0%，對替加環素敏感率為93.8%，是僅次于碳青霉烯類藥物及多黏菌素E敏感性較好的藥物，氨基糖苷類藥物中，對慶大霉素出現了72.8%的耐藥率，但是對阿米卡星的敏感性較好，達到了82.7%；對其他藥物如環丙沙星、四環素、復方磺胺甲噁唑等均表現出了較高的耐藥率。

表2 81株肺炎克雷伯菌藥敏試驗結果[n(%)]

2.3社區獲得性感染與醫院獲得性感染菌株藥敏試驗結果比較 44株社區獲得性感染菌株和37株醫院獲性感染菌株對抗菌藥物的耐藥率見表3。44株社區獲得性感染菌株和37株醫院獲得性感染菌株的藥敏結果比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 社區獲得性感染與醫院獲得性感染菌株 藥敏試驗結果(%)

2.4產ESBLs肺炎克雷伯菌的耐藥基因型 過PCR擴增測序的方法獲得產ESBLs肺炎克雷伯菌的耐藥基因型，擴增的基因型包括CTX-M-1、CTX-M-9、TEM、SHV，發現81株產ESBLs肺炎克雷伯菌均檢出ESBLs基因，其中TEM基因型陽性41株(50.62%)，SHV基因型陽性79株(97.53%)，CTX-M陽性51株(62.96%)，CTX-M-1基因型陽性29株(35.80%)，CTX-M-9基因型陽性26株(32.10%)，4株同時CTX-M-1與CTX-M-9基因型陽性。除16株攜帶單獨ESBLs基因外(社區獲得性感染7株，醫院獲得性感染9株)，其余的菌株均包含兩種以上ESBLs基因，有36株細菌同時攜帶兩種耐藥基因(44.44%)，有24株細菌攜帶3種以上耐藥基因(29.63%)。根據測序及結果比對，TEM陽性菌株全部為TEM-1基因型，SHV基因型陽性為SHV1和SHV11型，CTX-M型菌株均產ESBLs。81株細菌中，SHV基因型的檢出率最高，CTX-M+SHV基因型為60.49%，耐藥基因檢測結果見表4。

將37株醫院獲得性感染菌與44株社區獲得性感染菌的耐藥基因表型進行比較，社區獲得性感染菌在TEM、SHV、CTX-M-9基因型中陽性株均多于醫院獲得性感染菌株。在耐藥基因陽性株的比例上，CTX-M-9在社區獲得性感染菌中的攜帶率高于醫院獲得性感染菌攜帶率，差異有統計學意義(P<0.05)，其他的ESBLs基因型，如CTX-M-1、SHV、TEM基因型差異均無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表4 肺炎克雷伯菌的耐藥基因型

表5 社區與醫院獲得性肺炎克雷伯菌感染菌耐藥基因型比較(n)

3 討 論

肺炎克雷伯菌已成為社區和醫院獲得性感染中的重要病原菌，多重耐藥的產生和傳播給臨床治療帶來了很大的困難[5]，并且產ESBLs肺炎克雷伯菌可以經過傳導和整合等方式將耐藥質粒傳遞給其他細菌，導致耐藥現象更加嚴重[6-7]。本研究對81株肺炎克雷伯菌進行了21種抗菌藥物的藥敏檢測，結果發現青霉素類藥物已不適合臨床治療肺炎克雷伯菌引起的感染，而β-內酰胺酶抑制劑對于抑制菌株耐藥起到了明顯的作用。肺炎克雷伯菌對慶大霉素出現了72.8%的耐藥率，對其他藥物如環丙沙星、四環素、復方磺胺甲噁唑等均表現了較高的耐藥率。值得慶幸的是，在本地區，還沒有出現耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌，由此可見，美羅培南、亞胺培南、多黏菌素E、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦是目前本院治療肺炎克雷伯菌感染的最有效藥物[8]。

傳統觀念認為，社區獲得性感染菌株在對抗菌藥物的耐藥率上應該低于醫院獲得性感染菌株，其原因主要為醫院獲得性感染菌株面臨的抗菌藥物選擇壓力要遠遠大于社區獲得性感染菌株，也更容易進化成多重耐藥菌[9]。但是本研究數據顯示，社區獲得性感染菌株除對阿莫西林/克拉維酸、氨曲南、頭孢西丁、環丙沙星、復方磺胺甲噁唑這5種抗菌藥物的耐藥率比醫院獲得性感染菌株耐藥率低9.7%～20.3%外，兩者對其他抗菌藥物的耐藥率均比較接近，甚至有個別藥物如哌拉西林、頭孢呋辛等社區獲得性感染菌株耐藥率還略高于醫院獲得性感染菌株。由此看來，社區獲得性感染菌株很可能會和醫院獲得性感染菌株有傳播上的交叉，所以并不能認為社區獲得性感染菌株只在院外流行，同時，這些菌株獲得外源耐藥基因的能力并不差于醫院獲得性感染菌株，故造成社區獲得性感染菌株表現出的高耐藥性接近甚至超過了醫院獲得性感染菌株。

產ESBLs肺炎克雷伯菌引起的感染也在世界各地廣泛流行[10]。由于抗菌藥物使用觀念和策略差異及細菌對不同抗菌藥物的選擇性壓力不同，ESBLs流行類型在不同的國家和不同地區也有所不同[11]。有報道顯示，在北美及西歐地區主要流行TEM型 和SHV型，而在東歐地區、亞洲地區和南美地區多流行CTX-M 型[12-14]。同樣，在我國的不同地區，報道的優勢ESBLs基因型也不完全相同，廣東地區主要以CTX-M型為主，而TEM 型則在山西地區較常見[15]。而本研究在對81株產ESBLs的菌株進行常見的ESBLs基因篩查時發現，無論是社區獲得性感染菌株，還是醫院獲得性感染菌株，與以往研究報道不同的是SHV在本研究中的檢出率最高，達到了97.53%，大大超過了季淑娟等[16]研究報道的檢出率(13.24%)，同時攜帶CTX-M+SHV基因型菌株占60.49%。總之，本院ESBLs基因以CTX-M和SHV基因型為主。

隨著抗菌藥物的大量使用，產ESBLs肺炎克雷伯菌菌株耐藥性逐年上升，使臨床醫生在抗感染治療中面臨著很大的困難，臨床微生物室人員應該在日常工作中，根據細菌培養結果，加強細菌耐藥性的監測，及時準確地發出報告。同時，應加強多重耐藥菌的檢測和上報工作，并統計本院的病原菌及耐藥情況，制訂成冊，并聯合醫院感染科加強對臨床醫師進行培訓，讓他們能夠合理使用抗菌藥物，并重視抗菌藥物的使用和管理，醫護人員在日常操作中，應該加強無菌觀念，對于攜帶多重耐藥菌株的住院患者，應注意消毒和隔離，以防止其耐藥菌在院內及院外的傳播和流行。在對抗菌藥物耐藥率較高的肺炎克雷伯菌中，ESBLs基因攜帶率更高，故在日常工作中，在監測細菌耐藥性的同時，更應加強ESBLs基因的檢測。

4 結 論

綜上所述，在本地區無論是產ESBLs肺炎克雷伯菌菌株的耐藥率，還是ESBLs耐藥基因的攜帶率，社區獲得性感染菌與醫院獲得性感染菌均比較接近。