PD-L1、HBME-1在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達及臨床意義

周 翼，吳林軍，雷建東

(四川省樂山市中醫醫院檢驗科，四川樂山 614000)

甲狀腺癌可發生于任何年齡段，高發于中青年女性。甲狀腺癌初期可在甲狀腺內局限生長數年，可經淋巴管擴散至其他組織，其發病受激素、遺傳易感、環境等因素影響，缺碘、放射性物質照射、電離輻射過度、甲狀腺炎均可引起甲狀腺腫瘤[1]。患者常表現為頸部無痛性腫塊，少數患者會有吞咽困難癥狀。甲狀腺癌按照病理組織分型分為乳頭狀癌、髓樣癌、濾泡癌、低分化癌、未分化癌、鱗狀細胞癌，甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌中最常見的類型[2]。近年來，通過檢測各種生物標記物在腫瘤中的表達從而輔助診斷腫瘤已成為臨床研究熱點。人骨髓內皮細胞標記物-1(HBME-1)是內皮細胞微絨毛表面的一種抗原，在腫瘤血管形成及生長過程中發揮重要作用[3]。有研究發現，HBME-1在惡性間質腫瘤中高表達[4]，推測HBME-1可在臨床輔助診斷甲狀腺乳頭狀癌時發揮重要作用。程序性死亡因子配體-1(PD-L1)是程序性死亡因子的配體，已被多項研究證實存在于多種惡性腫瘤中。有研究報道PD-L1在肺癌細胞的免疫逃逸機制中發揮重要作用，它可通過與程序性死亡因子結合，促進T細胞凋亡，從而使肺癌細胞不被殺傷[5]。但目前，對PD-L1在甲狀腺乳頭狀癌中表達情況的研究較少。本研究通過檢測甲狀腺乳頭狀癌中HBME-1及PD-L1表達情況，探究兩種指標對評估腫瘤進展情況的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年4月至2019年5月本院收治的甲狀腺乳頭狀癌患者102例為研究對象。納入標準：(1)符合甲狀腺癌診斷標準[6]，經病理組織學檢查診斷為乳頭狀癌；(2)接受甲狀腺乳頭狀癌腫瘤切除手術；(3)年齡18～65歲。排除標準：(1)良性甲狀腺腫瘤；(2)合并其他惡性腫瘤；(3)合并免疫系統疾病；(4)合并感染性疾病；(5)哺乳期及妊娠期女性。通過手術切除患者病灶組織及癌旁甲狀腺正常組織，分別作為觀察組與對照組。本研究納入患者年齡26～65歲，平均(42.62±5.37)歲；男57例，女45例；已發生淋巴結轉移37例，未發生淋巴結轉移65例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期65例，Ⅲ～Ⅳ期37例。本研究獲得本院醫學倫理委員會批準，所有患者及家屬對本研究內容充分知曉，自愿簽署知情同意書。

1.2方法 對兩組甲狀腺組織進行免疫組化染色，免疫組化染色原理：以攜帶顯色劑的特異性抗體與抗原結合為理論基礎，觀察抗原抗體反應復合物在細胞中的呈色反應，對相應蛋白進行定性及定量分析[7-9]。方法：(1)將兩組病理組織進行常規石蠟包埋、切片、脫蠟、水化(同一患者制作兩張病理切片)，使用磷酸鹽緩沖液(PBS，上海莼試生物技術有限公司，貨號：CS-0779S)沖洗3次，每次2 min；(2)向切片中滴加3%過氧化氫溶液50 μL，室溫下放置10 min后使用PBS沖洗3次，每次2 min；(3)向切片中滴加50 μL山羊血清封閉液(愛必信上海生物科技有限公司，貨號：abs933)，室溫孵育30 min，使用PBS沖洗3次，每次2 min；(4)向切片中分別滴加PD-L1抗體(上海滬震實業有限公司，貨號：1234-00-00)、HBME-1抗體[艾博抗(上海)貿易有限公司]，4 ℃冰箱孵育一夜后使用PBS沖洗3 min；(5)向切片中滴加50 μL酶標鼠抗兔復合物，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，每次2 min；(6)向切片中滴加2滴DAB溶液(合肥康源生物科技有限公司，貨號：DAB002)染色，同時使用顯微鏡觀察，當鏡下觀察到棕色時終止染色，自來水沖洗1 min；(7)向切片中滴加蘇木素染液(上海源葉生物科技有限公司，貨號:R20568-100 mL)復染30 min，自來水沖洗2 min；(8)使用85%、95%、100%梯度酒精分別脫水5 min，二甲苯透明5 min，中性樹脂封片，貼標簽后顯微鏡觀察染色情況。陰性對照使用PBS代替酶標鼠抗兔復合物。

陽性結果判斷：HBME-1定位于細胞膜，觀察到細胞膜為棕黃色或棕褐色即為陽性，PD-L1定位于細胞膜或細胞質，觀察到細胞膜或細胞質為棕黃色或棕褐色即為陽性。每張切片選取5個高倍鏡視野，人工計數每個視野中陽性細胞數目，統計平均陽性細胞數。染色強度評分標準：無任何著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞數評分標準：陽性細胞數<總細胞數的30%為1分，陽性細胞數>總細胞數的30%為2分。染色強度評分×陽性細胞數評分為0～<2分表示陰性，2～<4分表示弱陽性、4～6分表示強陽性[10]。陽性率=(弱陽性例數+強陽性例數)/總例數×100%。

1.3觀察指標 (1)觀察組與對照組中PD-L1的免疫組化結果；(2)觀察組與對照組中HBME-1免疫組化結果；(3)PD-L1與HBME-1表達情況與甲狀腺乳頭狀癌一般特征的單因素分析，納入研究的因素包括年齡是否大于或等于45歲、性別、病灶大小、有無淋巴結轉移、腫瘤數量、是否侵犯包膜；(4)PD-L1、HBME-1表達情況與甲狀腺乳頭狀癌一般特征的多因素分析。

1.4統計學處理 采用SPSS22.0統計軟件進行數據處理及統計分析。計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用配對χ2檢驗；多因素分析采用Logistic回歸分析法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1兩組PD-L1免疫組化結果比較 PD-L1在觀察組中陽性率為69.61%(71/102)，明顯高于對照組的15.69%(16/102)，差異有統計學意義(χ2=60.625，P<0.001)，見表1。觀察組PD-L1陽性細胞也較多，對照組幾乎無PD-L1陽性細胞，見圖1。

表1 兩組PD-L1免疫組化結果比較

2.2兩組HBME-1免疫組化結果比較 HBME-1在觀察組中陽性率為73.53%(75/102)，明顯高于對照組的6.86%(7/102)，差異有統計學意義(χ2=94.291，P<0.001)，見表2。免疫組化結果顯示觀察組HBME-1陽性細胞較多，對照組幾乎無HBME-1陽性細胞，見圖1。

2.3PD-L1及HBME-1表達情況與甲狀腺乳頭狀癌一般特征的單因素分析 有淋巴結轉移、侵犯包膜患者PD-L1陽性率明顯高于無淋巴結轉移、侵犯包膜患者，差異有統計學意義(P<0.05)；有淋巴結轉移、侵犯包膜患者HBME-1陽性率明顯高于無淋巴結轉移、侵犯包膜患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.4PD-L1及HBME-1表達情況與甲狀腺乳頭狀癌影響因素的多因素分析 將單因素分析中差異有統計學意義(P<0.05)的因素納入多因素分析，結果顯示，PD-L1、HBME-1表達陽性均是淋巴結轉移及侵犯包膜的高危因素(P<0.05)，即PD-L1、HBME-1表達陽性率越高，患者腫瘤組織發生淋巴結轉移、侵犯包膜的風險越大，見表4。

表2 兩組HBME-1免疫組化結果比較

注：A為免疫組化染色陰性對照，無任何著色(×200)；B為HBME-1染色陽性細胞(×200)；C為HBME-1染色陰性細胞(×200)；D為PD-L1染色陽性細胞(×200)；E為PD-L1染色陰性細胞，幾乎無著色(×200)。

表3 PD-L1及HBME-1表達情況與甲狀腺乳頭狀癌影響因素的單因素分析[n(%)]

續表3 PD-L1及HBME-1表達情況與甲狀腺乳頭狀癌影響因素的單因素分析[n(%)]

表4 PD-L1及HBME-1表達情況與甲狀腺乳頭狀癌影響因素的多因素分析

3 討 論

甲狀腺乳頭狀癌患者早期癥狀不明顯，多數患者在體檢時通過B超發現甲狀腺結節，再通過體格檢查、病理組織學檢查進一步確診。一般甲狀腺乳頭狀癌未發生轉移的患者，經手術治療后10年生存率在80%以上。多數已出現淋巴結轉移患者不具有手術適應證或通過手術無法完全切除腫瘤，在姑息治療后預后情況較差。早期發現、確診，并進行手術治療是提高甲狀腺乳頭狀癌患者預后的重要手段。甲狀腺乳頭狀癌瘤體常為灰白色實質瘤，一般大小在1 cm以內；巨大甲狀腺乳頭狀癌瘤體可達到6 cm，瘤體常位于甲狀腺包膜周圍，導致包膜受到腫瘤侵犯[11]，其中心切面似乳頭狀，因此稱為乳頭狀腫瘤。但不是所有乳頭狀癌患者的病理標本均為典型乳頭狀，因此，僅依靠病理檢查診斷并不適用于所有患者。隨著分子生物學及免疫組化技術在醫學診斷、輔助診斷中的發展，高靈敏度、高特異度的分子標志物在輔助診斷腫瘤時的應用價值逐漸升高[12]。將特異性分子標志物應用于腫瘤篩查中可提示早期腫瘤病變、是否存在淋巴結轉移風險等。

HBME-1本質為一種酸性氨基酸多聚糖蛋白，常用于臨床診斷或鑒別診斷間皮細胞癌、胰腺癌、肺癌及乳腺癌，免疫組化中陽性表現為細胞膜黃染[13-15]。有研究發現，在甲狀腺乳頭狀癌中HBME-1表達量明顯高于良性增生的甲狀腺乳頭狀癌[16-17]，提示甲狀腺乳頭狀癌的惡性病變可能與HBME-1有關。PD-L1在多種癌癥中過表達，目前抗PD-L1藥物已獲得美國食品藥品監督管理局(FDA)批準，臨床常應用于治療尿路轉移性非小細胞肺癌[18]。

本研究通過對甲狀腺乳頭狀癌患者的病灶組織、癌旁正常組織進行免疫組化染色，發現觀察組中HBME-1及PD-L1陽性率明顯升高，提示HBME-1及PD-L1確實在甲狀腺乳頭狀癌組織中處于高表達狀態，其高表達可能與甲狀腺乳頭狀癌的發生、發展關系密切。將甲狀腺乳頭狀癌患者臨床一般特征與觀察組中的HBME-1、PD-L1陽性率進行單因素分析，結果顯示有淋巴結轉移、侵犯包膜患者PD-L1陽性率明顯升高，與曹益嘉等[19]研究結果具有一致性，提示PD-L1高表達可能與甲狀腺乳頭狀癌發展進程有關。年齡、性別、病灶大小及腫瘤數量與PD-L1表達陽性無明顯關系，但曹益嘉等[19]研究結果還表明年齡≥45歲甲狀腺乳頭狀癌患者中的PD-L1陽性率較高，可達到79%，與本研究年齡因素研究結果不一致。分析原因可能是由于本研究納入樣本量不足，雖然≥45歲患者PD-L1陽性率可達到76.47%，但與<45歲患者比較，差異無統計學意義(P>0.05)。HBME-1也在有淋巴結轉移、侵犯包膜的甲狀腺乳頭狀癌患者中陽性率較高，與病灶大小、性別、腫瘤數量無明顯關系。進一步多因素分析結果顯示，PD-L1、HBME-1高表達是甲狀腺乳頭狀癌患者發生淋巴結轉移及侵犯包膜的危險因素，與甲狀腺乳頭狀癌發展進程密切相關，提示PD-L1、HBME-1高表達的甲狀腺乳頭狀癌患者具有高淋巴結轉移、侵犯包膜風險。

4 結 論

PD-L1與HBME-1在甲狀腺乳頭狀癌病灶組織中過表達，兩者表達量過高與患者腫瘤發生淋巴結轉移及侵犯包膜有關。PD-L1與HBME-1均可作為甲狀腺乳頭狀癌發展過程中的敏感分子標記物，可應用于臨床輔助診斷患者病情發展，指導臨床選擇合適的治療方案。但由于納入樣本量有限，本研究未對PD-L1與HBME-1在甲狀腺乳頭狀癌中的高表達機制進行深入研究，后續可對PD-L1與HBME-1在甲狀腺乳頭狀癌中被激活的信號通路進行分析，為完善PD-L1與HBME-1在甲狀腺乳頭狀癌中表達及其作用機制提供一定參考價值。