Xpert? Xpress Flu/RSV Assay用于臨床呼吸道感染病原學診斷的價值*

袁 穎，謝爭華，唐詩歡，陳滿君，范笑地，余 楠△

(1.南方醫科大學珠江醫院檢驗醫學部/廣東省突發傳染病病原微生物重點實驗室，廣東廣州 510282；2.中國醫學科學院腫瘤醫院深圳醫院檢驗科，廣東深圳 518116；3.中山大學附屬第七醫院檢驗科，廣東深圳 518107)

呼吸道感染是門診患者就診的常見原因[1]，病原體種類繁多，相關病毒有十余種，其中流感病毒(Flu)和呼吸道合胞病毒(RSV)是影響最廣泛、感染率最高的呼吸道感染病毒[2-5]。Flu擴散極快，每年在一定區域暴發流行[6]，2018、2019年我國均有較大規模流行，2019年1月我國報道2018年感染Flu死亡人數超過2017年全年的3倍[7]。世界衛生組織統計，北半球每年約1億人感染Flu[8]。RSV則主要侵犯兒童，2～3歲兒童感染率幾乎為100%[9]，全球5歲以下兒童每年約3 300萬感染RSV，占所有呼吸道感染病原體的20%，死亡人數為6.6萬至19.9萬[10-11]。呼吸道感染病毒檢測方法包含病毒分離、病毒抗原或抗體免疫學檢測及核酸檢測等。由于檢測成本、技術復雜程度、實驗室條件要求較高等原因，以聚合酶鏈反應(PCR)為技術基礎的實時熒光定量PCR(qPCR)、反轉錄PCR(RT-PCR)等核酸分子檢測方法在基層醫院用于呼吸道感染病毒檢測并不現實[12]。近年來，針對呼吸道感染病毒檢測的反轉錄實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)多重檢測儀器越來越多[13-14]，基于GeneXpert?平臺的3種呼吸道感染病毒組合多重檢測系統(Xpert?Xpress Flu/RSV Assay，以下簡稱Xpress Flu/RSV)將核酸提取、PCR和結果判斷整合為一體，并實現全自動化，較好地解決了技術操作煩瑣和生物安全防護的難題。本研究在2018年冬春季采用Xpress Flu/RSV對有急性呼吸道感染癥狀患者的鼻咽拭子標本進行檢測，與普通PCR測序及自建RT-qPCR兩種方法進行比較，評估其對主要呼吸道感染病毒的檢測能力，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2018年1月11日至5月9日南方醫科大學珠江醫院收治的具有發熱、咳嗽、鼻塞、流涕、咽喉疼痛、頭痛、肌肉痛等呼吸道感染癥狀的420例患者作為研究對象。患者年齡0～82歲，平均(20.3±10.5)歲；男233例(55.5%)，女187例(44.5%)；門診患者379例(90.2%)，住院患者41例(9.8%)；診斷主要包括呼吸道感染177例(42.1%)，肺炎67例(16.0%)，流感13例(3.1%)，咽炎/扁桃體炎5例(1.2%)，其他158例(37.6%)。本研究經南方醫科大學珠江醫院醫學倫理委員會批準后進行，所有研究對象均自愿參與本研究，并簽署知情同意書。

1.2標本采集 采用植絨拭子(Copan，意大利)采集所有研究對象鼻咽拭子，采集后放入密封采樣管(內含3 mL病毒保存液)，置于冰盒內運送至實驗室立即檢測，或4 ℃暫存(不超過24 h)進行檢測，剩余標本-80 ℃保存備用。

1.3Xpress Flu/RSV檢測 標本振蕩混勻，一次性移液管吸取300 μL標本至檢測盒標本倉，檢測盒掃碼后置于核酸檢測儀(Cepheid，美國)，反應34 min，自動檢測并判定結果。引物和探針包括以下序列：甲型流感基質(M)、甲型流感堿性聚合酶(PB2)、甲型流感酸性蛋白(PA)、乙型流感基質(M)、乙型流感非結構蛋白(NS)、RSV A型(RSVA)和RSV B型(RSVB)核衣殼基因。每個檢測試劑盒均含有標本處理質控品(SPC)和探針檢查質控品(PCC)。SPC用于質控靶序列的充分提取和處理，監測PCR反應中是否存在抑制劑，即SPC在陰性標本中應為陽性，在陽性標本中既可以為陰性，也可以為陽性。PCC用于驗證試劑的再水化，檢測盒中PCR管的填充、探針完整性和染料穩定性。

1.4普通PCR測序 標本提取RNA，經反轉錄和PCR擴增，引物序列由Cepheid公司提供。普通PCR過程簡述如下：反應體系共25.0 μL，焦碳酸二乙酯(DEPC)處理并滅菌的MiliQ純水(DEPC水)5.5 μL，上下游引物混合物5.0 μL，360反應混合物12.5 μL，cDNA模板2.0 μL。循環參數分為6種，(1)甲型流感病毒(FluA) M程序，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個循環；72 ℃ 5 min。(2)FluA PB2程序，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，45個循環；72 ℃ 5 min。(3)乙型流感病毒(FluB) M程序，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40個循環；72 ℃ 1 min。(4)FluB NS程序，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個循環；72 ℃ 5 min。(5)RSVA程序，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40個循環；72 ℃ 5 min。(6)RSVB程序，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個循環；72 ℃ 5 min。擴增產物瓊脂糖凝膠電泳陽性，進行Sanger雙向測序。Sequencher4.1.4軟件分析結果并與參考序列比對。以擴增產物有條帶，Sanger測序結果符合目標序列時為陽性。PCR測序由廣州金域醫學檢驗中心完成。

1.5實驗室自建18種(型/亞型)呼吸道感染病毒RT-qPCR法[15]Xpress Flu/RSV和普通PCR測序結果不一致標本，采用自建方法確認，以任意兩種方法結果一致為參考標準，計算診斷效能。簡述如下：高純度病毒RNA試劑盒(Megan，中國)提取核酸；RT-qPCR反應體系共20.0 μL,TaqManTM快速病毒一步法檢測混合試劑(Invitrogen，美國)5.0 μL，DEPC水7.5 μL，上下游引物各1.0 μL，探針0.5 μL，核酸模板5.0 μL；循環參數分為兩種：(1)呼吸道RNA病毒程序(FluA、FluA亞型H1N1-9、FluA亞型H3N2、FluB、副流感病毒1型、冠狀病毒1型、冠狀病毒OC43、冠狀病毒NL63、冠狀病毒229E、鼻病毒)，50 ℃ 10 min，95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s，40個循環。(2)呼吸道DNA/RNA病毒共同程序(腺病毒、人博卡病毒、RSVA、RSVB、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、人偏肺病毒)，50 ℃ 10 min，95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環。以上述臨床分離毒株為陽性質控品，以采樣系統病毒培養液為陰性質控品。采用ABI Vii7TM real time PCR儀檢測。

1.6統計學處理 采用SPSS20.0統計軟件進行數據處理及統計學分析。計數資料以例數或百分率表示，不同方法間的比較采用配對χ2檢驗，Kappa檢驗分析一致性；門診和住院兩類陽性患者Ct值的比較采用兩獨立樣本非參數檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1檢測總體情況 420例患者標本中，Xpress Flu/RSV檢測陽性213例(50.7%)，其中檢出單個病原體感染209例(49.8%)：FluA 61例(14.5%)，FluB 104例(24.8%)，RSV 44例(10.5%)；檢出兩種或以上病原體感染共4例(1.0%)，其中FluA+FluB陽性1例(0.2%)，FluA+RSV陽性3例(0.7%)。

420例患者標本中，自建RT-qPCR檢測到其他呼吸道感染病毒15例(3.6%)，分別是鼻病毒10例(2.4%)，腸道病毒3例(0.7%)，腺病毒+鼻病毒+副流感病毒3型陽性1例(0.2%)，人偏肺病毒陽性1例(0.2%)。Xpress Flu/RSV和普通PCR測序對這15例患者標本進行FluA、FluB、RSV檢測均為陰性。

2.2Xpress Flu/RSV檢測性能 以任意兩種方法結果一致為參考，Xpress Flu/RSV總靈敏度為100.0%(95%CI:97.8%～100.0%)，總特異度為99.7%(95%CI:99.1%～99.9%)，陽性預測值、陰性預測值分別為98.6%(95%CI:95.7%～99.6%)和100.0%(95%CI:99.5%～100.0%)。檢測各病原體的靈敏度分別為FluA 100.0%(95%CI:93.1%～100.0%)，FluB 100.0%(95%CI:95.5%～100.0%)，RSV 100.0%(95%CI:90.4%～100.0%)；特異度分別為FluA 100.0%(95%CI:98.7%～100.0%),FluB 99.4%(95%CI:97.5%～99.9%)，RSV 99.7%(95%CI:98.3%～100.0%)；陽性預測值、陰性預測值分別為FluA 100.0%(95%CI:93.1%～100.0%)和100.0%(95%CI:98.7%～100.0%)，FluB 98.1%(95%CI:92.6%～99.7%)和100.0%(95%CI:98.5%～100.0%)，RSV 97.9%(95%CI:87.3%～99.9%)和100.0%(95%CI:98.7%～100.0%)。Xpress Flu/RSV檢測FluA的結果與參考方法完全一致；FluB和RSV分別有2例和1例Xpress Flu/RSV檢測為陽性，參考方法為陰性。見表1。

2.3Xpress Flu/RSV與自建RT-qPCR的比較 420例患者標本中有95例進行了自建RT-qPCR檢測。對比分析結果，Xpress Flu/RSV與自建RT-qPCR的總陽性符合率、陰性符合率均較高，分別為92.4%(95%CI:82.5%～97.2%)和100.0%(95%CI:97.9%～100.0%)，一致性強，Kappa值為0.949(P<0.001)。兩種方法檢測各病原體的Kappa值如下：FluA 0.957(P<0.001)，FluB 0.876(P<0.001)，RSV 0.978(P<0.001)，其中兩種方法檢測FluB的一致性低于另外兩種病原體，見表2。

表1 Xpress Flu/RSV診斷結果(n)

表2 Xpress Flu/RSV與自建RT-qPCR結果一致性分析

2.4門診和住院檢測陽性患者Ct值的比較 經Xpress Flu/RSV共檢測出陽性患者213例，包括27例住院患者，186例門診患者，門診和住院兩類患者的Ct值進行兩獨立樣本非參數檢驗，差異有統計學意義(P=0.005)。

3 討 論

呼吸道感染發病率極高，病原體種類繁多，引起的呼吸道感染臨床表現相似。明確病原體，對于避免濫用抗菌藥物[16]，及早開展針對性的抗病毒治療，把握治療時機，判斷預后具有重要意義。

GeneXpert?快速分子診斷平臺對標本制備和RT-PCR過程進行了全自動化。基于該技術平臺開發的檢測項目目前以單項PCR為主，如金黃色葡萄球菌、結核分枝桿菌及利福平耐藥性檢測等[17-19]。Xpress Flu/RSV為三重PCR檢測，標本用量少，檢測快速(34 min完成)，整個過程在封閉試劑盒中進行，極大程度減少了污染的風險，自動化程度高，隨到隨檢，可實現床邊和急診實驗室檢測，為臨床篩查或病原學診斷提供了較好的選擇。

經臨床標本評估發現，以Xpress Flu/RSV、普通PCR測序和自建RT-qPCR任意兩種方法結果一致為參考，Xpress Flu/RSV與參考方法一致性較高，但檢測FluB和RSV出現3例假陽性結果，可能由于Xpress Flu/RSV檢測過程中存在核酸污染或非特異性擴增導致。由于普通PCR測序方法靈敏度一般低于熒光PCR法，普通PCR測序檢測RSV的檢測限為100.0 TCID50/mL；Xpress Flu/RSV對兩種RSVA毒株和兩種RSVB毒株的檢測下限均≤2.3 TCID50/mL。自建RT-qPCR法檢測靈敏度與Xpress Flu/RSV接近，不同之處在于單重檢測，手工提取核酸。比較這兩種方法的檢測結果發現，Xpress Flu/RSV與自建RT-qPCR一致性好。以上對比試驗中FluA、FluB和RSV的陰性預測值、陰性符合率均高達100.0%，表明Xpress Flu/RSV靈敏度高，假陰性結果或漏檢率低，適合用于呼吸道感染病毒初篩；雖然存在假陽性結果，但概率低，具有較高檢測性能。

國內學者將Xpress Flu/RSV與中國食品藥品監督管理局批準的RT-qPCR進行比較，3種病毒檢測的一致性為94.7%～99.1%，Xpress Flu/RSV檢測FluA的靈敏度、特異度分別為100.0%、98.6%，檢測FluB的靈敏度、特異度分別為100.0%、99.2%，RSV靈敏度、特異度分別為 90.5%、99.7%[20]，對Xpress Flu/RSV檢測性能的評價與本研究結果相似，但RSV靈敏度比本研究稍低，原因可能是入選的受試者比例的差異，本研究住院患者較少(9.8%)，上述研究住院患者(77.8%)所占比例較大，而住院患者RSV檢出率更高[3]。國外有研究將Xpress Flu/RSV與美國疾病預防控制中心研發的RT-qPCR檢測結果進行比較，檢測FluA的靈敏度和特異度分別為98.6%、99.3%；檢測FluB的靈敏度和特異度分別為97.9%、99.4%；檢測RSV的靈敏度和特異度分別為98.1%、99.4%[21]，與本研究結果接近。綜合分析國內外相關研究[20-23]，雖參考方法不同，對Xpress Flu/RSV的檢測性能評價基本一致。Xpress Flu/RSV已在美國和歐洲批準上市，在我國于2019年批準，尚未推廣，Xpress Flu/RSV對我國檢出率較高，以及在呼吸道感染病毒占比較大的Flu和RSV檢測性能較高[24-25]，具有較好應用前景。

檢測Ct值與病毒載量呈線性相關，有研究對Xpress Flu/RSV檢測的Ct值與不同類別受試者的關聯進行了探索，住院患者由于病程較長，檢測時病毒載量一般低于處于感染急性期的門診患者[20]。本研究比較了住院患者(27例)和門診患者(186例)的Ct值，差異有統計學意義(P=0.005)，提示門診患者較住院者更易獲得陽性檢測結果。

本研究存在一定局限，合并感染和其他病原體感染標本的數量較少，且經自建RT-qPCR檢測的標本數較少，故缺少更有力的統計學數據；研究時間跨度較小，檢測標本均在2018年冬春流感季采樣，僅一個中心的數據，時間和空間的代表性不足，有待更多實踐來驗證其臨床應用性能。

4 結 論

Xpress Flu/RSV檢測性能好，自動化程度高，使用方便、快捷，是流感流行期大規模人群篩查和呼吸道感染病毒感染病原學診斷的良好選擇。