iTRAQ聯合Nano LC-MS/MS技術在早期類風濕關節炎患者血清中的差異表達蛋白質組學研究*

劉 琴，嚴小倩，胡紅兵

(1.華中科技大學同濟學院附屬武漢兒童醫院輸血科，湖北武漢 430015；2.浙江省立同德醫院檢驗科，浙江杭州 310012；3.浙江省立同德醫院腎內科，浙江杭州 310012)

類風濕關節炎(RA)是一種慢性全身性自身免疫性疾病，以關節滑膜炎為特征。早診斷、早治療對有效預防關節破壞的進展，及時控制病情，并改善預后具有重要意義[1-3]。本研究利用同位素標記相對和絕對定量技術(iTRAQ)聯合納升液相色譜-串聯質譜(Nano LC-MS/MS)技術，對早期RA患者血清中的蛋白質進行鑒定和相對定量分析，并用生物信息學工具對生物學過程、細胞定位、分子功能、參與的信號通路進行富集分析。

1 資料與方法

1.1一般資料 將浙江省立同德醫院2017年8月至2018年1月收治的44例早期RA患者作為病例組，男17例，女27例；平均(56.97±16.57)歲；所有患者均符合2010年歐洲抗風濕病聯盟(EULAR)聯合美國風濕病學會(ACR)發布的RA診斷標準；病程小于6個月，且未服用過抗風濕藥物。選擇同期浙江省立同德醫院50例體檢健康者納入對照組；男20例，女30例；平均(51.26±13.06)歲；排除肝功能損傷、腎功能損傷、自身免疫性疾病、腫瘤、感染及傳染病者，排除查體或血生化檢查有異常者。本研究獲得浙江省立同德醫院醫學倫理管理委員會批準后進行。

1.2儀器與試劑 液相色譜儀(島津LC-20AD)、液相色譜儀(Thermo Dionex Ultimate 3000 RSLC nano，二維)、質譜儀(Thermo Scientific Q Exactive)、冷凍離心機(湘儀，H2050R)、超聲儀(新芝生物，LTD JY96-ⅡN)、酶標儀(TECAN SUNRISE)。血清高豐度蛋白去除試劑盒(Sigma，批號：PROTBA-1KT)、丙酮(Thermo Fisher)、BCA 蛋白水平測定試劑盒(碧云天生物，批號：P0010S)、iTRAQ 試劑盒(ABSciex，批號：4381664);10K超濾管(Pall，批號：OD010C33)、三乙胺-碳酸緩沖液(TEAB，Sigma，批號：T418)、胰酶(Promega，批號：V5280)、甲酸(Fluka，批號：14265)、乙腈(Thermo Fisher，批號：A998-4)、甲酸銨(Sigma，批號：516961)、放射免疫沉淀法(RIPA)強裂解液(碧云天生物，批號：P0013B)、蛋白酶抑制劑(PMSF，凱基生物，批號：KGP610)。

1.3方法

1.3.1標本采集 取所有研究對象用于生化檢驗的血清標本100 μL，-80 ℃保存備用。

1.3.2蛋白提取 按照血清高豐度蛋白去除試劑盒說明書，去除血清中的高豐度蛋白后加入4倍體積丙酮，-20 ℃沉淀過夜。將沉淀得到的蛋白4 ℃、12 000 r/min離心20 min，去掉上清，晾干，-80 ℃保存備用。BCA法定量檢測蛋白質水平。

1.3.3蛋白酶解、標記 蛋白定量檢測后取200 μg蛋白溶液置于離心管中；按iTRAQ 試劑盒說明書操作，得到100 μL酶解后的樣品。分別用iTRAQ試劑114、116進行標記后，混合，真空干燥。

1.3.4液相分離 將標記后的多肽混勻上樣，進行第一維分析，根據峰型和時間共收取24個組分，用50%三氟乙酸(TFA)酸化，真空干燥后，進行第二維液相色譜-串聯質譜分析。色譜柱流動相A：20 mmol/L甲酸胺，pH值為10。流動相B：20 mmol/L甲酸胺，80%乙腈，pH值為10。流速：200 μL/min。紫外檢測波長：214 nm/280 nm。

1.3.5質譜鑒定 肽段用含2%乙腈、 0.1%甲酸樣品溶解液溶解，振蕩渦旋，4 ℃，13 500 r/min 離心20 min，取上清液轉至上樣管中，進行質譜鑒定，分離后的肽段進行在線分析，并將質譜原始數據轉化成mfg文件，利用AB Sciex 的檢索軟件ProteinPilotTMSoftware4.5進行檢索，比對鑒定。

1.3.6生物信息學分析 將各組差異表達蛋白在UniProt數據庫中進行比對，并利用UniProt數據庫中蛋白序列進行GO注釋，對差異表達蛋白進行基于GO的細胞定位、分子功能和生物學過程進行富集分析。對差異表達蛋白進行 KEGG(http:/ /www.Kegg.jp/kegg/pathway.html)生物學通路富集分析。

2 結 果

2.1質譜鑒定分析結果 本研究共鑒定到343種蛋白，以差異倍數大于1.30或小于0.77，P<0.05為差異表達蛋白。共檢測差異表達蛋白113種，包含呈上調趨勢的蛋白41種和呈下調趨勢的蛋白72種，差異倍數較大的20種蛋白見表1。

表1 差異倍數較大的20種呈上調或下調趨勢的蛋白

2.2GO富集分析 通過GO富集分析，篩選出差異表達蛋白主要的細胞定位、分子功能及參與的生物學過程。這些差異表達蛋白主要定位在血液微粒、胞質囊泡腔、囊腔等結構，見圖1。這些差異表達蛋白的分子功能主要包括肝素結合、肽酶活性調節、糖胺聚糖結合等，見圖2。這些差異表達蛋白主要參與蛋白質活化級聯反應、急性炎性反應、凝血調節等生物學過程，見圖3。

注：1為血液微粒；2為胞質囊泡腔；3為囊腔；4為分泌顆粒腔；5為血小板α顆粒；6為脂蛋白顆粒；7為蛋白質-脂蛋白復合物；8為細胞外基質；9為內質網內腔；10為內吞小泡。

注：1為肝素結合；2為肽酶活性調節；3為糖胺聚糖結合；4為肽酶活性抑制；5為硫化合物結合；6為內肽酶活性調節；7為酶活性抑制；8為絲氨酸型內肽酶活性；9為細胞黏附分子結合；10為內肽酶活化。

2.3KEGG通路分析 將差異表達蛋白進行KEGG通路分析，發現這些蛋白主要富集于補體和凝血級聯反應、金黃色葡萄球菌感染等12條 KEGG 通路，見表2。

2.4STRING蛋白-蛋白相互作用網絡分析 通過STRING蛋白-蛋白相互作用網絡分析發現，一些差異表達蛋白和其他差異表達蛋白間存在廣泛的相互作用，即在蛋白-蛋白相互作用網絡中起到關鍵作用，在差異表達蛋白中具有關鍵作用的蛋白有AHSG、FN1、ITIH3、PLG、PROS1、SERPINC1、F2、FGG、CLU、SEPP1等,在網絡中與多個差異表達蛋白發生相互作用，是網絡的關鍵節點，是研究RA機制的候選蛋白。

注：1為蛋白質活化級聯反應；2為急性炎性反應；3為凝血調節；4為創傷愈合調控；5為體液免疫應答；6為蛋白質加工；7為纖溶調節；8為補體激活；9為細胞外結構排列；10為細胞與底物黏附的調節。

表2 差異表達蛋白KEGG通路分析

3 討 論

RA是一種自身免疫性疾病，其發病機制至今尚未明確。目前，臨床上診斷RA主要依靠免疫學檢查及影像學資料，然而疾病的發生往往先是功能和分子標志物的變化，繼而是形態學的改變。RA發病較隱匿，早期的臨床表現大多不典型，容易造成誤診、漏診，RA患者首次就診時往往就已存在關節損傷，甚至累及多器官[1-3]。因此，尋找能反映早期RA疾病活動情況的分子標志物，在患者出現關節功能異常之前，監測RA的發展情況具有重要的臨床意義。

蛋白質組學可以從細胞水平及整體水平來研究蛋白質的組成、定位、表達水平、修飾及其動態變化規律等，揭示蛋白質功能與細胞的活動規律[4-5]。iTRAQ聯合質譜的定量蛋白質組學技術具有高靈敏度、標記效率高、高分辨率、樣品兼容性好、重復性好等獨特優勢[6-7]，已廣泛地應用于腫瘤[8-9]、阿爾茲海默病[10]、骨性關節炎[11-12]等多種疾病中。

本研究應用iTRAQ聯合Nano LC-MS/MS技術篩選出早期RA患者與對照者之間具有明顯差異的蛋白113種，利用GO富集分析了這些差異表達蛋白主要的細胞定位、分子功能及參與的生物學過程、主要信號通路，并通過KEGG通路注釋進一步提取到與差異表達蛋白相關的12條KEGG通路，這些結果表明凝血纖溶系統、免疫系統、脂質代謝、細胞骨架重建與早期RA的發病機制密切相關。凝血纖溶系統異常是RA的特異性表現之一，RA患者體內存在凝血系統及抗凝系統的失衡，并由此引發其他系統相關疾病[13-14]。GO富集分析結果發現在凝血調節、纖溶調節生物學過程中有28種差異表達蛋白參與。KEGG通路分析結果發現，補體和凝血級聯反應信號通路的差異最大，有15種差異表達蛋白參與這一通路，其中補體相關的差異表達蛋白也參與了金黃色葡萄球菌感染、系統性紅斑狼瘡等通路。由此可見，凝血纖溶系統的異常與免疫系統的異常密切相關。RA 患者多伴有血管炎性反應，這與免疫復合物沉積、纖溶系統亢進、微循環障礙有關[15-16]。臨床工作中在檢測炎癥因子同時，也可以通過檢測患者的凝血纖溶指標來監測疾病的發展情況。KEGG通路分析結果表明早期RA差異表達蛋白APOC1、APOE、APOH、LCAT與膽固醇代謝相關，這也證實了RA患者疾病的炎性反應與心血管疾病風險相關，RA疾病活動度升高有可能增加冠狀動脈疾病的發生風險[17-18]。因此，可以通過檢測APOC1、APOE、APOH、LCAT等與膽固醇代謝相關的指標反映疾病的相關情況，改善患者的膽固醇代謝可以緩解RA疾病的發展，預防動脈硬化的發生。

本研究通過STRING蛋白-蛋白相互作用網絡分析發現，AHSG、FN1等蛋白是RA發病機制的關鍵節點。AHSG具有調理作用，可促進細胞內吞，與鈣離子和鋇離子親和力高，是具有影響骨礦化作用的蛋白。研究表明AHSG可能在骨與軟骨的發育中起重要作用[19-20]。此外，AHSG與炎癥因子的調控有關。BRYLKA等[21]研究發現，AHSG減少可以引起機體炎性反應，導致軟骨病變。FN1在成骨細胞的代謝中發揮著重要的作用，是成骨細胞在成骨過程中不可或缺的蛋白[12，22]。本研究發現，黏著斑、ECM-受體相互作用、癌癥與蛋白多糖、肌動蛋白細胞骨架的調節等多條信號通路與RA的發生、發展均存在密切關系。因此，血清中AHSG和FN1蛋白可作為早期診斷RA的候選生物標志物。

iTRAQ聯合Nano LC-MS/MS技術通過比較、分析疾病個體的差異表達蛋白，尋找疾病特異性的蛋白質，為疾病的早期診斷與預后提供可能的新型標志物，對疾病的預防、診斷、預后判斷和療效監測具有積極作用，為設計新藥物的分子靶點提供實驗數據。

4 結 論

本研究從差異表達蛋白質組學的角度出發，通過iTRAQ結合Nano LC-MS/MS技術成功得到了早期RA血清差異表達蛋白，并對差異表達蛋白進行生物信息學分析，為研究RA的發病機制提供了實驗室數據，也為RA的診斷和治療提供了新思路，為尋找新的監測疾病療效的實驗室指標提供了線索。