基于MALDI-TOF-MS技術建立非小細胞肺癌診斷預測模型及其初步驗證*

宋御繁，周亞男，張 婷，王娜娜，陳英劍▲，胡成進△

(1.山東第一醫科大學/山東省醫學科學院，山東泰安 271016；2.中國人民解放軍第九六〇醫院實驗診斷科，山東濟南 250031；3.濰坊醫學院醫學檢驗學系，山東濰坊 261053)

肺癌是世界范圍內癌癥患者死亡的主要原因，全球每年新發肺癌患者約180萬例，肺癌死亡人數占癌癥死亡總人數的18.4%[1]。肺癌患者中約85%為非小細胞肺癌(NSCLC)[2]。由于早期發病隱匿，超過75%的NSCLC患者初診時已為中晚期，喪失最佳的手術治療時機，5年生存率低于15%[3]。為了提高NSCLC患者的長期生存率，必須對患者進行早期、正確的診斷及治療。目前，支氣管鏡取組織活檢是診斷肺癌的常用方法，但其為有創檢查，可對患者造成一定損傷，不適用于所有患者。CT的應用在一定程度上提高了肺癌的早期診斷率，但其假陽性率高，且存在輻射的危害[4]。傳統的血清腫瘤標志物作為最常用的肺癌初篩方法，靈敏度和特異度較低，缺乏足夠的臨床有效性，不適合用于肺癌的早期診斷。因此，臨床上迫切需要更有效的檢測方法輔助早期診斷NSCLC。近年來，致力于尋找腫瘤標志物的蛋白質組學研究多采用質譜技術。然而，由于血液蛋白質水平范圍較大，對蛋白質組學分析提出了挑戰。低豐度蛋白在疾病早期可能具有一定特異性，但由于高豐度蛋白的優勢掩蓋，傳統質譜技術無法對其進行準確檢測[5]。基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)作為一種新興蛋白質組學研究技術，將質譜技術與磁珠技術相結合，利用磁珠選擇性純化血清中的低豐度蛋白，通過MALDI-TOF-MS直接分析，具有高靈敏度、高特異度、高通量的特點，為尋找NSCLC早期診斷的腫瘤標志物提供了新的發展方向和技術支持。本研究旨在應用MALDI-TOF-MS技術結合ClinProTools系統分析NSCLC患者及體檢健康者血清蛋白質指紋圖譜，從中篩選差異蛋白/多肽，建立診斷預測模型，并評估其臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2018年10月至2019年6月中國人民解放軍第九六〇醫院收治的具有完整臨床資料的56例NSCLC患者作為病例研究對象，其中男33例，女23例；年齡25～72歲，中位年齡62歲。病例納入標準：(1)患者經組織病理學活檢初次確診為NSCLC；(2)既往未經其他手術治療及放化療；(3)具有完整臨床病理學診斷資料；(4)無其他惡性腫瘤病史。選擇56例同期門診體檢健康者作為健康對照者，其中男37例，女19例；年齡26～75歲，中位年齡61歲。健康對照者納入標準：(1)經體檢各項檢測指標均正常；(2)無腫瘤，無糖尿病、高血壓等代謝性疾病，無炎癥性疾病，無心、肝、腎等重要臟器疾病；(3)無手術史及輸血史。按照3∶1比例將病例與健康對照者隨機分為訓練組(NSCLC患者42例，體檢健康者42例)和驗證組(NSCLC患者14例，體檢健康者14例)。訓練組用以建立NSCLC診斷模型；驗證組用以評估模型的診斷效能。各組中NSCLC患者與體檢健康者一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表 1。

表1 各組一般資料比較

1.2儀器與試劑 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀(Autoflex Speed MALDI-TOF /TOF MS)購自德國Bruker Daltonics公司；2114型號磁珠分離器購自美國Life Technologies公司；低溫高速離心機購自德國Eppendorf公司；弱陽離子交換磁珠(WCX-MB)試劑盒、MTP AnchorChip 384 BC靶板購自德國Bruker Daltonics公司；FlexControl、ClinProTools系統軟件；蛋白/多肽標準品購自德國Bruker Daltonics公司；α-氰基-4羥基肉桂酸(HCCA)、色譜級無水乙醇(HPLC)、色譜級乙腈(CAN)、三氟乙酸(TFA)均購自美國Sigma-Aldrich公司；雙蒸水購自捷世康生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1標本采集 采集所有受試者清晨空腹靜脈血5 mL于真空采血管中，室溫下靜置30 min，3 000 r/min離心5 min。將離心后的標本取上層血清分裝至0.5 mL EP管中，每管100 μL，置于-80 ℃冰箱凍存。

1.3.2磁珠提取血清蛋白/多肽 將凍存血清標本從-80 ℃冰箱取出，分別在-20 ℃和4 ℃冰箱逐步復融8 h和6 h，復融后4 ℃ 10 000 r/min 離心 3 min。以下操作步驟均于冰上進行：(1)取10 μL WCX-MB試劑和10 μL結合緩沖液(BB)于0.5 mL EP管中，加樣槍上下吸打混勻；(2)向EP管中加入5 μL血清，混勻后靜置5 min，避免產生氣泡；(3)磁珠分離器分離磁珠1 min，棄去上清；(4)向EP管中加入100 μL洗滌緩沖液(WB)，于磁珠分離器上將兩樣品管交換移動10次，靜置1 min，棄去上清；(5)重復步驟(4)兩次；(6)加入5 μL洗脫緩沖液(EB)，充分混勻，避免產生氣泡，于磁珠分離器上貼壁靜置2 min，將上清液移入新EP管中；(7)向EP管中加入5 μL穩定緩沖液(SB)，混勻后進行MALDI-TOF-MS分析。

1.3.3儀器校準與質量控制 檢測前使用蛋白/多肽混合標準品對儀器進行校正。隨機選取30例體檢健康者血清標本各5 μL混合成質量控制樣品，以評估質譜儀的穩定性。將質量控制樣品經磁珠提取蛋白/多肽后，每15個標本點一次靶。經質譜上樣檢測后將獲得的質譜峰進行比較，評估質譜儀的重復穩定性。

1.3.4MALDI-TOF-MS技術檢測標本 取1 μL蛋白/多肽標本點到MTP AnchorChip 384 BC靶板上，每份標本點靶3次。取1 μL現配制的6 mg/mL基質(50%CAN，2%TFA，6 mg HCCA)點于干燥后的樣品點上，自然放置干燥后將靶板放入質譜儀中檢測。應用FlexControl 軟件采集標本質譜圖，參數設置：正離子線行模式(LP)下，采用75%的激光強度，在相對分子質量范圍為 (1～10 )×103內采集數據，每個樣品點累計轟擊100×20次。

1.4統計學處理 應用ClinProTools系統軟件對質譜圖進行數據分析與處理，包括基線消減、校正和歸一化，選取信噪比(S/N)≥5 的峰進行分析。分別采用遺傳(GA)算法、快速分類(QC)算法和監督神經網絡(SNN)算法建立模型，使用驗證組驗證模型的準確度、特異度和靈敏度，結合三者選擇最佳診斷預測模型。

2 結 果

2.1質量控制標本結果分析 試驗過程中每15個標本點進行一次質量控制靶點，經質譜檢測后得到7個質量控制標本血清蛋白/多肽質譜圖，選取相對分子質量為(1～10)×103的7個峰，計算同批次內重復性變異系數(CV)均值為19.01%(范圍為12.57%～25.81%)，儀器在整個試驗過程中重復穩定性良好。

2.2血清蛋白/多肽指紋圖譜分析 采用ClinProTools系統軟件對NSCLC患者及體檢健康者原始圖譜進行分析，得到NSCLC患者與體檢健康者的血清蛋白質/多肽指紋圖譜，見圖1。在質荷比 (m/z)為(1～10)×103時，篩選出差異有統計學意義[P<0.000 001，受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)>0.80]的多肽峰11個，具體結果見表2。除m/z為5 906.73、3 242.63、2 953.73的峰在NSCLC患者中表達上調以外，其余8個峰均表達下調。其中m/z為5 906.73與2 953.73的兩個峰差異最明顯，其AUC分別為0.96與0.86，NSCLC患者多肽峰m/z 5 906.73與m/z 2 953.73的峰強度明顯高于健康對照者，其平均譜峰圖及ROC曲線見圖 2。

注：A為NSCLC患者血清蛋白/多肽指紋圖譜；B為體檢健康者血清蛋白/多肽指紋圖譜。

表2 NSCLC患者與體檢健康者差異蛋白/多肽峰

續表2 NSCLC患者與體檢健康者差異蛋白/多肽峰

注：A、B分別為m/z 5 906.73與m/z 2 953.73的平均譜峰圖；a、b分別為m/z 5 906.73與m/z 2 953.73的ROC曲線。

2.3NSCLC診斷預測模型建立及驗證 應用ClinProTools系統軟件分別基于GA、SNN、QC這3種不同算法建立診斷模型，并使用驗證組驗證模型診斷效能，結果見表3。經驗證比較發現，GA算法模型效能最佳：選取差異最明顯的2個峰m/z 5 906.73和m/z 2 953.73分別作為X、Y軸做聚類分析，結果見圖3，NSCLC患者與體檢健康者兩組間區分明顯。在GA算法模型下進行驗證組驗證：14例NSCLC患者中正確判斷13例，錯誤判斷1例；14例體檢健康者中正確判斷11例，錯誤判斷1例，另2例未識別。得到GA模型靈敏度為92.9%，特異度為91.7%，準確度為92.3%。

表3 3種診斷預測模型的診斷效能(%)

注：A為驗證組NSCLC患者血清標本聚類分析結果；B為驗證組體檢健康者血清標本聚類分析結果；×為訓練組NSCLC患者，圓形為訓練組體檢健康者，▲為驗證組體檢健康者。

3 討 論

近年來，蛋白質組學的不斷發展為腫瘤特異性生物標志物的發現打開了新的思路。目前，質譜分析是腫瘤蛋白質組學檢測的核心技術，主要包括表面增強激光解析電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)[6]、MALDI-TOF-MS等，其中SELDI-TOF-MS所使用的蛋白芯片有效表面積較小，對于低豐度蛋白富集不完全[7]，不能完整反映低豐度蛋白所含有的生物標志物信息。此外，由于自身技術可重復性較差，易受多種因素影響，對于相同疾病的研究，兩個不同實驗室獲得的結果較難達到一致[8]。傳統蛋白質組學研究工具二維凝膠電泳(2D-PAGE)技術費時費力，操作復雜，技術本身存在有限的動態覆蓋范圍，對低豐度蛋白分離效果不佳[9]。而基于磁珠分離技術的MALDI-TOF-MS與ClinProTools生物信息學分析相結合是近年來新開發的一種高重現性、高分辨率的新型蛋白質組學技術，其優點在于不僅可以利用多種磁珠從復雜樣品中篩選生物標志物及其特異性指紋圖譜，還可利用串聯質譜(MS/MS)技術同時識別潛在的特異性蛋白。本研究中采用WCX-MB富集血清中的低豐度蛋白/多肽，能夠排除大分子蛋白的干擾，只需5 μL血清即可快速獲得患者的蛋白/多肽指紋圖譜，此技術操作簡便、準確度高，將高通量的樣品處理系統與高效能的生物信息學分析工具相結合，使試驗結果更加可靠，適用于大量標本檢測。

肺癌的發生和發展是一個多步驟的過程[10]，其特征是異常基因改變和蛋白表達導致細胞表型的轉化及腫瘤加速進展，這個過程涉及復雜的分子信號通路和多種細胞蛋白[11]。除肺癌的遺傳學特征外，還需解決其對蛋白質生物標志物的需求，以便能夠對肺癌進行準確的早期診斷，監測疾病進展[12]。LIN等[13]同樣采用WCX-MB提取肺腺癌患者與體檢健康者血清標本中的低豐度蛋白，通過ClinProTools系統軟件建立診斷預測模型，靈敏度為94%，特異度為95%，此研究與本試驗獲得的峰大多不同，只有m/z 2 104.83與m/z 4 054.06的峰與本試驗中m/z 2 105.66及m/z 4 055.47的峰結果相近，有待于對其進行Mascot蛋白數據庫搜索驗證及二級質譜鑒定。

本研究通過MALDI-TOF-MS技術與ClinProTools系統軟件相結合，運用GA算法建立NSCLC診斷預測模型，具有較高的靈敏度和特異度，適合用于NSCLC高危人群的篩查及輔助診斷。篩選出的m/z 5 906.73與m/z 2 953.73差異蛋白/多肽有望成為NSCLC潛在的腫瘤標志物，但由于標本量較少，研究結果存在偏倚的可能性。此次試驗中使用WCX-MB提取差異性蛋白/多肽，不能代表血清中的全部蛋白/多肽譜，可能導致試驗結果不全面，在后續的試驗中需結合其他多種類型的磁珠或方法對血清標本進行前處理。此外，研究中使用的標本主要來源于肺腺癌患者，且患者多為晚期，在后續研究中會進一步擴大標本量，納入更多早期患者及肺鱗癌等其他組織學類型患者的血清標本，豐富試驗內容，細化分組，進一步驗證該診斷預測模型的診斷效能。對于本試驗所獲得的差異蛋白/多肽，后續會通過高效液相色譜-電噴霧串聯質譜(LC-ESI-MS/MS)法對其進行鑒定，以進一步研究候選血清腫瘤標志物在NSCLC發病機制中的生物學作用。

4 結 論

本試驗基于高通量MALDI-TOF-MS技術聯合ClinProTools系統軟件建立NSCLC診斷預測模型，能夠以較高的靈敏度和特異度鑒別NSCLC患者和體檢健康者，具有較好的診斷效能。同時，研究發現兩個具有診斷價值的差異蛋白/多肽有望成為新的NSCLC血清腫瘤標志物，為后續鑒定及體內生物學效應研究奠定了基礎，具有重大臨床意義。