外周傷害性刺激對大鼠腦和脊髓星形膠質細胞膠質纖維酸性蛋白表達的影響

李 震 郭 靈

(1 廣西衛生職業技術學院人體形態學教研室,南寧市 530021,電子郵箱：421980848@qq,com；2 廣西醫科大學人體解剖教研室,南寧市 530021)

星形膠質細胞參與許多疾病的病理過程。膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是星形膠質細胞的骨架蛋白之一,其表達情況在星形膠質細胞受到刺激時發生相應的變化,是反映星形膠質細胞被激活的標志物之一[1-3]。中樞神經系統(central nervous system,CNS)損傷時,星形膠質細胞由常態轉變為反應性星形膠質細胞[4-5],后者在CNS對損傷的反應中起著重要作用,包括形成瘢痕和清除變性的突觸末梢,此時GFAP含量也明顯增加。星形膠質細胞在神經元受損時反應性上調GFAP水平,因此,GFAP可作為研究CNS損傷后膠質細胞反應的一個客觀指標[6-7]。但是目前有關外周傷害性疼痛刺激是否對星形膠質細胞產生影響,國內外的研究報道仍較少。故本研究分析外周傷害性刺激對大鼠腦和脊髓星形膠質細胞GFAP表達的影響,現報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選取30只Wistar 純系雄性大鼠,56日齡,體重180～290 g,由廣西醫科大學醫學實驗動物中心提供[合格證號:桂檢字(2003)第0005號],飼養環境溫度控制在25℃～28℃,通風、自然采光。

1.2 主要試劑和儀器 主要試劑：小鼠抗大鼠GFAP單克隆抗體(批號：20170318)以及親和素-生物素復合物(avidin-biotin complex,ABC)試劑盒(批號：20170419)、粉末型二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)(批號：20170312)均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；水合氯醛(分析純，批號：20130513)購自四川成都市科龍化工試劑廠；多聚甲醛(分析純，批號：20120409)購自上海溶劑廠；30%過氧化氫(分析純，批號：20130611)購自重慶川江化學試劑廠；無水乙醇(分析純，批號：20110509)購自上海振興化工廠；二甲苯(分析純，批號：20110315)購自廣州化學試劑廠；檸檬酸(分析純，批號：20110318)購自天津市化學試劑一廠；檸檬酸鈉(分析純，批號：20120513)購自廣州化學試劑廠。實驗儀器：江灣Ⅰ型C大鼠立體定位儀(上海川沙花木農機廠)；Leica RM 2253輪轉式石蠟切片機(德國Leica公司)；ZHPY型恒溫式附貼切片展片儀(河北醫學院)；202-1型電熱干燥箱(上海縣第二五金廠)；CHS型光學顯微鏡(日本Olympus光學有限公司)；AE-240型電子分析天平(Mettler-Toledo儀器有限公司)；BCD-108CT型低溫冰箱(河南新飛電器有限公司)；DG-401型電熱恒溫孵育箱(天津市實驗儀器廠)；0.25 mm×25 mm無菌針灸針(北京漢醫醫療器械中心)。

1.3 動物分組及干預方法 按隨機數字表將30只大鼠分為實驗組(n=18)、假手術組(n=6)、正常對照組(n=6),其中實驗組又分1 h組(n=6)、3 h組(n=6)及6 h組(n=6)。實驗組大鼠在清醒狀態下,用組織鉗迅速打斷大鼠左側前肢的尺骨、橈骨及右側后肢的脛、腓骨中段,造成多發性、閉合性骨折；假手術組大鼠在清醒狀態下,用組織鉗輕輕夾取大鼠左側前肢的尺骨、橈骨及右側后肢的脛、腓骨中段；正常對照組大鼠則不予任何刺激處理。

1.4 標本獲取 分別在刺激后1 h、3 h、6 h獲取實驗組大鼠的腦和脊髓標本。給予3.5%水合氯醛(1.2 mL/100 g體重)腹腔注射進行麻醉,快速開胸,經左心室插管至升主動脈,剪開右心耳,快速灌注pH 7.4的生理鹽水100～200 mL,然后按先快后慢次序灌注4%多聚甲醛500 mL(0.1 mol/L 磷酸緩沖液配制,pH 7.4),于30～40 min完成灌注。灌注完畢后,首先去除大鼠顱蓋骨,將大鼠頭部準確地安置在大鼠腦立體定位儀上,參照大鼠腦立體定位圖譜[8],切取出腦組織(前囟前1.70 mm至前囟后0.92 mm、前囟后0.92 mm至前囟后3.80 mm)各兩塊，此范圍的腦組織包括全部扣帶回皮質(cg1)、第一軀體感覺區、斜角帶以及部分背側海馬,每塊大小約為3 mm×1.5 cm×1 cm；然后去除大鼠脊柱暴露脊髓,切取脊髓頸膨大(大小為1.5 mm×5 mm×1 mm)和腰骶膨大(2 mm×5 mm×1 mm)。將腦與脊髓組織塊放置于4%多聚甲醛固定液后固定3 h(4℃)后,用自來水沖洗腦組織2～3次,再將所有腦與脊髓組織放于盛有蒸餾水的燒杯中漂洗(30 min/次，6次)；脫水透明：70%乙醇(4 h)→80%乙醇(4 h)→90%乙醇(2 h)→95%乙醇(2 h)→100%Ⅰ乙醇(1.5 h)→100%Ⅱ乙醇(1 h)→100%乙醇與二甲苯1 ∶1溶液(0.5 h)→二甲苯Ⅰ(0.5 h)→二甲苯Ⅱ(0.5 h),此時組織塊已完全脫水與透明；浸蠟：石蠟Ⅰ(58℃,1 h)、石蠟Ⅱ(58℃,1 h)、石蠟Ⅲ(54℃,過夜)；包埋：鐵板架包埋,蠟塊大小約為2 cm×1 cm×1.5 cm,要求快速冷卻。假手術組、正常對照組均與實驗1 h組同時用相同的方法取材。

1.5 染色方法 在正式進行免疫組織化學反應前均需將石蠟組織切片常規脫蠟至水：二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→二甲苯Ⅲ,每步驟各10 min。脫去切片中的石蠟；下行梯度乙醇入水：100%乙醇Ⅱ→100%乙醇Ⅰ→95%乙醇→85%乙醇→70%乙醇→60%乙醇→50%乙醇,每級乙醇脫水5 min以去除二甲苯；雙蒸餾水漂洗10 min(次)，2次,以去除乙醇；磷酸緩沖鹽溶液漂洗5 min(次)，2次,待進行相關的免疫反應。

取常規腦冠狀冰凍切片及脊髓水平冰凍切片,片厚40 μm,將0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)放入微波盒中,用微波爐煮沸后插入已脫蠟至水的組織片進行抗原微波修復,將溫度控制在95℃～98℃,修復1.5 min,自然冷卻至室溫。用0.01 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液(pH 7.4)漂洗2次,5 min/次。室溫下用3%過氧化氫(雙蒸水配制)消除切片內源性過氧化物酶催化活性15 min,再用0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液漂洗3次，5 min/次。用正常山羊血清工作液封閉組織中的抗原10 min(37℃),傾去工作酶,勿洗,并保持組織濕潤。加入小鼠抗大鼠GFAP單克隆抗體(1 ∶1 000)4℃過夜；然后用0.01 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，5 min/次。加生物素兔抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：20170415)(1 ∶200)室溫孵育2 h。0.01 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，5 min/次。加標記的卵白素(ABC復合物)室溫孵育2 h。0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，5 min/次。DAB試劑盒顯色,37℃顯色約2 min,自來水充分沖洗終止顯色反應。脫水透明：70%乙醇(4 h)→80%乙醇(4 h)→90%乙醇(2 h)→95%乙醇(2 h)→100%Ⅰ乙醇(1.5 h)→100%Ⅱ乙醇(1 h)→100%乙醇與二甲苯1 ∶1溶液(0.5 h)→二甲苯Ⅰ(0.5 h)→二甲苯Ⅱ(0.5 h)、中性樹膠封片。

選取每只大鼠腦組織前囟前1.2 mm的切片和前囟后3.14 mm的切片,在40倍物鏡×10倍目鏡的光學顯微鏡下分別觀察和計數每張切片的扣帶回皮質(cg1)、第一軀體感覺區、斜角帶和海馬各亞區CA1、CA2、CA3及齒狀回雙側視野內的陽性細胞數(單位：個/視野),然后取雙側視野的平均數作為該腦區的陽性細胞計數的原始數據。取脊髓的頸膨大和腰骶膨大水平切片，在10倍物鏡×10倍目鏡定位脊髓后角,在40倍物鏡×10倍目鏡的光學顯微鏡下分別觀察和計數每張切片的左右側灰質后角的陽性細胞數(單位：個/視野)。陽性細胞為深棕褐色。

1.6 統計學分析 采用SPSS 10.0軟件進行統計學分析。計量資料用(x±s)表示,多組間比較采用方差分析,兩兩比較用LSD-t法檢驗,組內比較采用配對t檢驗。P<0.05表示差異統計學有意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠各相關腦區GFAP陽性細胞數量 1 h組大鼠端腦3個區域(扣帶回皮質、第一軀體感覺區、斜角帶)、海馬各亞區(CA1、CA2、CA3)及齒狀回的GFAP陽性細胞數量均高于其余各組(均P<0.05),3 h組端腦3個區域、海馬各亞區及齒狀回的GFAP陽性細胞數量均高于6 h組、假手術組及正常對照組(均P<0.05),而6 h組、假手術組及正常對照組的各相關腦區GFAP陽性細胞數量差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表1、表2。

表1 5組大鼠端腦3個區域GFAP陽性細胞數比較(x±s,個/視野)

表2 5組大鼠海馬各亞區及齒狀回GFAP陽性細胞數比較(x±s,個/視野)

2.2 各組大鼠脊髓頸膨大后角GFAP陽性細胞 除正常對照組外，其余各組大鼠脊髓頸膨大后角傷側GFAP陽性細胞數量均高于健側(均P<0.05)。1 h組大鼠大鼠脊髓頸膨大后角傷側GFAP陽性細胞數量均高于3 h組、6 h組、假手術組及正常對照組(均P<0.05),3 h組大鼠脊髓頸膨大后角傷側GFAP陽性細胞數量均高于6 h組、假手術組及正常對照組(均P<0.05),而6 h組、假手術組及正常對照組大鼠脊髓頸膨大后角傷側GFAP陽性細胞數量差異均無統計學意義(均P>0.05)。各實驗組、假手術組及正常對照組組大鼠脊髓頸膨大后角健側GFAP陽性細胞數量差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表3。

表3 5組大鼠頸膨大后角雙側GFAP陽性細胞數比較(x±s,個/視野)

2.3 各組大鼠脊髓腰骶膨大后角GFAP陽性細胞的變化 除正常對照組外，其余各組大鼠腰骶膨大后角傷側GFAP陽性細胞數量均高于健側(均P<0.05)。1 h組大鼠大鼠腰骶膨大后角傷側GFAP陽性細胞數量均高于3 h組、6 h組、假手術組及正常對照組(均P<0.05),3 h組大鼠腰骶膨大后角傷側GFAP陽性細胞數量均高于6 h組、假手術組及正常對照組(均P<0.05),而6 h組、假手術組及正常對照組大鼠腰骶膨大后角傷側GFAP陽性細胞數量差異均無統計學意義(均P>0.05)；各實驗組、假手術組及正常對照組組大鼠腰骶膨大后角健側GFAP陽性細胞數量差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表4。

表4 5組大鼠脊髓腰骶膨大后角雙側GFAP陽性細胞數變化(x±s,個/視野)

3 討 論

疼痛在脊髓水平的調節和整合一直被認為只與脊髓神經元及其遞質有關,而神經膠質細胞被認為僅對神經元起著支持和營養作用,不具有細胞之間的信號傳遞功能。然而,用完全由神經元參與的模型卻無法解釋一些疼痛現象,如獲得性免疫缺陷綜合征、區域外疼痛、鏡像痛等[9]。有研究表明,神經膠質細胞參與急性疼痛的發生和維持,激活后參與許多重要的生理功能,如釋放促炎性因子、神經營養因子、信號轉導等,在急性疼痛的調節過程中發揮重要作用[10-11]。此外，孫濤等[11]還發現脊髓灰質后角星形膠質細胞的增殖活化參與了慢性疼痛的發生與維持。脊髓灰質I和Ⅱ層是脊髓中神經結構和化學成分最復雜的區域,是傷害性信息出入的第一站,主要接受高閾值傷害性感受器的初級感覺傳入,其中含有大量的突觸球結構,相互構成各種類型的突觸,在傷害性信息調節中起重要作用[13-14]。而脊髓灰質第Ⅲ、Ⅳ層相當于激素背角固有核所在部位,有很多背角大細胞,在疼痛感知中起關鍵作用,被稱為T細胞(Tract Cell),其接受從背根傳來的外周傷害性刺激,將信息傳遞到腦組織；四肢的神經纖維傳入脊髓背角后,終止于背角神經元及星形膠質細胞,而四肢傷害性刺激后的痛覺超敏癥狀與此類纖維及脊髓背角上行投射纖維密切相關[15]。本研究結果顯示,大鼠脊髓灰質后角中實驗組大鼠脊髓傷側的GFAP陽性細胞數均比健側的顯著增多(P<0.05),且胞漿著色明顯,細胞較肥大,這些變化可能是星形膠質細胞被激活后,其標志物GFAP的表達也顯著升高的結果。這提示星形膠質細胞有可能與神經元共同參與形成回路網絡連接,對疼痛進行負性調節。此外，在本研究中,大鼠傷側脊髓后角的GFAP陽性細胞數在不同時間段的表達存在著差異,具體表現為1 h組>3 h組>6 h組(均P>0.05),說明多發性閉合性傷害性刺激后1 h,大鼠的星形膠質細胞增殖且功能活躍,而3 h后開始降低,其數量在6 h后降至更低。

大腦皮層作為感覺整合的最高級中樞,接受各種感覺傳入信息,并進行加工,最終上升到認知階段。研究表明,急性疼痛可激活對側的腦區,包括大腦軀體感覺區、前扣區、前額皮層,提示這些腦區參與急性疼痛的中樞信息加工[16]。研究證實,神經元可塑性變化和中樞敏感化在疼痛的產生和維持中具有關鍵作用[17-18],但星形膠質細胞的作用卻少見報道。因此,本研究對大鼠相關腦區的星形膠質細胞進行了定量觀察,結果顯示,1 h及3 h組大鼠的大腦皮質、海馬、齒狀回、扣帶回皮質的GFAP陽性細胞數量較假手術組與正常對照組增多(均P<0.05),這些變化可能是由于脊髓后角的神經元及星形膠質細胞被激活后,神經沖動通過神經纖維上行傳導到以上相應的腦區，并激活其中的神經元及星形膠質細胞引起的。本研究中,實驗組大鼠的大腦第一軀體感覺區、海馬區、齒狀回、扣帶回皮質的GFAP陽性細胞數量隨刺激時間的變化趨勢與傷側的脊髓灰質后角幾乎相同,即為1 h組>3 h組>6 h組(均P<0.05),這提示腦內各區感覺神經元和星形膠質細胞與脊髓的相互協作,導致中樞過敏化,從而參與痛覺的發生、維持、調節的過程,故在傷害性信息傳遞模式中,脊髓與相關腦區關系可能發生相互作用。此外，在信息傳遞中未必只有激活神經元興奮后才激活膠質細胞的模式,還可能存在著神經元與膠質細胞同時興奮或者膠質細胞興奮后激活神經元的模式,而后兩種模式很有可能是由于傷害性刺激造成星形膠質細胞膜電位的改變，從而通過不同的細胞連接來影響神經元的興奮性實現的[17]。故神經元與膠質細胞的相互作用，可能在CNS的痛覺信息處理中起著重要作用。

綜上所述,外周傷害性刺激可同時激活大鼠脊髓灰質后角和腦相關各區的星形膠質細胞,腦和脊髓相關區域GFAP陽性細胞數增加。在傷害性信息傳遞模式中,脊髓與相關腦區可能相互作用,星形膠質細胞可能與神經元一起共同參與形成回路網絡連接,對疼痛進行負性調節。