丹曲林對慢性心力衰竭大鼠心室細胞鈣運轉及心功能的影響

胡冬冬 劉韜 石少波 黃燕 梁颯 胡丹

[摘要] 目的 探討丹曲林（DTL）對慢性心力衰竭（CHF）大鼠心室細胞鈣運轉及心功能的影響。 方法 將57只雄性SD大鼠按隨機數字表法分為對照組、CHF組和干預組（n = 19），分別給予生理鹽水、異丙腎上腺素（ISO）及ISO+DTL連續注射2周。干預2周后，行血流動力學和血清腦鈉肽（BNP）水平檢測。分離心室細胞，采用動緣探測系統記錄心肌細胞收縮;心肌細胞鈣熒光染料Fura-2 AM孵育后記錄心室細胞鈣瞬變（CaT），測量內質網鈣容量（[Ca2+]SR）。Western blot檢測心室Ryanodine 2型受體（RyR2）、內質網鈣泵（SERC2a）及受磷蛋白（PLB）表達量。結果 與對照組比較，CHF組左室舒張末期壓力（LVEDP）、血清BNP水平、心室細胞舒張期Ca2+水平（[Ca2+]i）均顯著升高（P < 0.01），CaT衰減時間、心室細胞收縮達峰時間（TP）及細胞舒張50%時間（TR50）均顯著延長（P < 0.01），而左室收縮末期壓力（LVESP）、心室收縮期壓力上升及舒張期下降最大速度（±dP/dtmax）、心室細胞收縮百分比、CaT幅度、[Ca2+]SR、心室RyR2及SERCA2a表達量均顯著降低（P < 0.01）。與CHF組比較，干預組LVEDP、血清BNP水平、[Ca2+]i均顯著降低（P < 0.01），CaT衰減時間、TP及TR50均顯著縮短（P < 0.01），而LVESP、±dP/dtmax、心室細胞收縮百分比、CaT幅度、[Ca2+]SR、心室RyR2及SERCA2a表達量均顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）。 結論 DTL干預可改善CHF大鼠心功能，可能與DTL修復心室細胞鈣運轉有關。

[關鍵詞] 心力衰竭;丹曲林;鈣運轉

[中圖分類號] R541? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）06（b）-0004-05

Effects of Dantrolene on calcium handling of ventricular myocytes and cardiac function in rats with chronic heart failure

HU Dongdong? ?LIU Tao? ?SHI Shaobo? ?HUANG Yan? ?LIANG Sa? ?HU Dan

Department of Cardiology， People′s Hospital of Wuhan University? Cardiovascular Research Institute of Wuhan University Hubei Key Laboratory of Cardiology， Hubei Province， Wuhan? ?430060， China

[Abstract] Objective To discuss the effects of Dantrolene （DTL） on calcium handling of ventricular myocytes and cardiac function in rats with chronic heart failure （CHF）. Methods According to the random number table method， 57 adult male SD rats were assigned to control group， CHF group and intervention group （n = 19）， which were given normal saline， Isoproterenol （ISO）， and ISO+DTL， for 2 weeks. Two-week later， the hemodynamic parameters and serum B-type natriuretic peptide （BNP） level were measured. The ventricular myocytes were isolated， then the cell contractility was automatically detected by the video edge-detector system. The calcium transient （CaT） and sarcoplasmic reticulum （SR） calcium content （[Ca2+]SR） were recorded by loading cardiomyocytes with Fura-2 AM. The protein levels of ryanodine receptor 2 （RyR2）， SR Ca2+-ATPase （SERCA2a） and phospholamban （PLB） were detected by Western blot. Results Compared with control group， left ventricular end diastolic pressure （LVEDP）， serum BNP level， diastolic intracellular Ca2+ level （[Ca2+]i） were significantly increased in CHF group （P < 0.01）， decay time constant （tau） of CaT， time to peak （TP） of cell contraction， time to 50% cell relaxation （TR50） were significantly extended in CHF group （P < 0.01）， while left ventricular end systolic pressure （LVESP）， ±dP/dtmax， cell shortening percentage， CaT amplitude， [Ca2+]SR， the protein levels of RyR2 and SERCA2a were significantly decreased in CHF group （P < 0.01）. Compared with CHF group， LVEDP， serum BNP level， [Ca2+]i， decay time constant of CaT were significantly decreased in intervention group （P < 0.01）， decay time constant of CaT， TP of cell contraction， TR50 were significantly shortened in intervention group （P < 0.01）， whereas， LVESP， ±dP/dtmax， cell shortening percentage， CaT amplitude， [Ca2+]SR， the protein level of RyR2 and SERCA2a were markedly increased in intervention group （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion DTL treatment can improve cardiac function in rats with CHF， which may be related to the repair of calcium handling of ventricular myocytes by DTL.

[Key words] Heart failure; Dantrolene; Calcium handling

慢性心力衰竭（CHF）是心血管疾病發展的終末階段，嚴重危害人類健康。心肌細胞鈣運轉異常是CHF發生的重要機制[1-4]。丹曲林（DTL）是一種Ryanodine受體（RyR）穩定劑，臨床上常用于惡性高熱的治療。有證據顯示，DTL具有修復心肌細胞鈣穩態的作用[5-7]。本研究通過DTL持續干預CHF大鼠，探討DTL對CHF大鼠心室細胞Ca2+運轉及心功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Ⅱ型膠原酶（美國Worthington公司，222-938-1）;鈣熒光指示劑Fura-2 AM（美國Invitrogen公司，E0801A）;戊巴比妥鈉（武漢眾一生物，774080）;普通臺式液配方（mmol/L）：NaCl 130、KCl 5.4、CaCl2 1.8、MgCl2 1.0、Na2HPO4 0.3、HEPES 10.0和Glucose 10.0，NaOH調節pH至7.4;異丙腎上腺素（ISO）、DTL、ryanodine 2型受體（RyR2）抗體（英國Abcam公司，gr324870-4）、肌漿網鈣泵（SERCA2a）抗體（英國Abcam公司，gr318-2545-3）及受磷蛋白（PLB）抗體（英國Abcam公司，gr3207682-3）;血流動力學檢測換能導管（美國Millar公司，型號：micro-tip）;血流動力學記錄PowerLab采集系統及分析軟件Chart 7.0軟件（澳大利亞AD公司，型號：4SP）;心肌細胞邊緣探測及鈣成像系統（美國Ionoptix公司，型號：6.5.1.92）;大鼠腦鈉肽（BNP）-32酶聯免疫吸附測定試劑盒（武漢華聯科生物，437YNZJ3BT）。

1.2 實驗分組

雄性SD大鼠（n = 57），購自武漢大學醫學部實驗動物中心，體重200～250 g，采用隨機數字表法將其分為對照組、CHF組和干預組（n = 19）。參照文獻[8-9]，CHF組給予ISO[5 mg/（kg·d）]腹腔注射，干預組腹腔注射ISO[5 mg/（kg·d）]和DTL[2 mg/（kg·d）]，對照組則注射生理鹽水[1 mL/（kg·d）]，所有藥物連續注射2周。

1.3 血流動力學評價

每組選取8只動物麻醉后，分離右頸總動脈，將一根2F的換能導管插入右頸總動脈直至左心室。穩定10 min后，采用PowerLab/4SP系統和Chart 7.0軟件開始記錄心內壓力信號和心率，測量左室收縮末期壓力（LVESP）、左室舒張末期壓力（LVEDP）、心室收縮期壓力最大上升速度（+dP/dtmax）及舒張期壓力最大下降速度（-dP/dtmax），用以評價心功能。

1.4 血清BNP水平檢測

動物完成血流動力學實驗后，自心臟取血2 mL，血液室溫靜置1 h后給予5000 r/min（r = 8 cm）離心5 min制備血清。采用BNP-32酶聯免疫吸附測定試劑盒檢測血清BNP水平。具體檢測步驟按照相關說明書進行，每個樣本測量2次，以pg/mL表示。

1.5 心肌細胞分離

每組選取6只動物肝素化（400 U，腹腔注射）10 min后麻醉開胸，剪下心臟，行主動脈插管后連接于離體心臟Langendorff系統。參照文獻[10]，采用Ⅱ型膠原酶灌注法進行心室肌細胞分離。將收集的心室細胞逐步復鈣（終濃度為1 mmol/L Ca2+），用于鈣成像實驗。

1.6 心肌細胞收縮力及鈣成像實驗

每組選取15個心肌細胞，應用可視化動緣探測系統及鈣熒光顯微鏡進行心室細胞收縮力及鈣成像實驗。心肌細胞肌小節收縮幅度由系統自動采集及分析。參照既往研究行鈣成像實驗[10]，通過一對鉑金電極發放場刺激（1 Hz，2倍起搏閾值，脈寬2 ms），記錄8個連續的心室細胞鈣瞬變（CaT）。選取5個CaT計算平均值，參照既往研究[11]測量心室細胞舒張期Ca2+濃度（[Ca2+]i）、CaT幅度及CaT衰減時間。此外，參照既往文獻[12]，采用咖啡因誘導的CaT評價心肌細胞內質網鈣容量（[Ca2+]SR），步驟如下：心室細胞完成Fura-2 AM負載后，給予1 Hz場刺激2 min，隨后停止刺激，于細胞正上方滴入咖啡因（10 mmol/L），記錄咖啡因誘發的CaT，測量CaT幅度用以評價[Ca2+]SR。

1.7 鈣運轉關鍵蛋白表達量檢測

每組選取5只動物麻醉后開胸，剪下心臟，取左心室組織放置于-80℃冰箱保存。使用RIPA裂解緩沖液提取心肌標本總蛋白，隨后進行蛋白濃度的測定。各樣品取50 μg蛋白上樣電泳，根據蛋白分子量配制相應使用的PAGE膠電泳。對心室RyR2、SERCA2a及PLB表達量進行Western blot檢測。

1.8 統計學方法

統計學分析及作圖均采用Graphpad prism 5.0軟件。本研究中連續變量采用均數±標準差（x±s）表示，采用單向方差分析進行多組間比較，采用Tukey post hoc檢驗進行組間兩兩比較。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心功能指標比較

與對照組比較，CHF組LVESP及±dP/dtmax顯著降低，而LVEDP和血清BNP水平顯著升高（P < 0.01）。與CHF組比較，干預組LVESP及±dP/dtmax顯著升高，而LVEDP和血清BNP水平則顯著降低（P < 0.01）。見圖1。

2.2 各組大鼠心室細胞機械功能指標比較

與對照組比較，CHF組心室細胞收縮達峰時間（TP）及心肌細胞舒張50%時間（TR50）均顯著延長（P < 0.01），而心室細胞收縮百分比顯著降低（P < 0.01）。與CHF組比較，干預組心室細胞TP及TR50均顯著縮短（P < 0.01），而心室細胞收縮百分比顯著升高（P < 0.01）。見圖2。