利用CRISPR/Cas9 技術建立PTEN敲除的人子宮內膜腺癌細胞模型及其功能研究

李宇恒，鄧誠思，關愛偉，宋曉宇，馮艷玲，關奕，曹流

（中國醫科大學轉化醫學研究院，沈陽 110122）

張力蛋白同源的第 10 號染色體缺失的磷酸酶（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）是一個具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN通過調控過磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，Pl3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）和絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路的平衡，參與細胞凋亡、細胞周期阻滯、細胞遷移等信號通路，發揮其抑癌功能［1］。PTEN表達的缺失可見于多種腫瘤，可能與癌癥的進展和轉移有關［2］。

常間回文重復序列叢集/常間回文重復序列叢集關聯蛋白9（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/Cas9，CRISPR/Cas9）系統是一種在小向導RNA（small guide RNA，sgRNA）的指導下在基因組水平上對目的基因DNA序列進行改造的定點編輯技術，可實現目的基因的完全敲除。自目標設計始，基因修飾可在1～2周內完成，修飾的克隆細胞株可在2～3周內獲得［3］。CRISPR/Cas9因其高效率和高精度得到了廣泛的關注。本研究擬利用CRISPR/Cas9 系統建立PTEN基因靶向敲除細胞株，探討PTEN對子宮內膜癌細胞生物學功能的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養和主要試劑

1.1.1 細胞培養：用含10%胎牛血清（中國Clark公司）、1%青霉素和鏈霉素（中國GENVIEW公司）的DMEM培養基（德國BI公司），在37 ℃、5%CO2培養箱內培養人子宮內膜腺癌細胞株KLE（美國ATCC公司），細胞呈貼壁生長。

1.1.2 主要試劑：DL2000 DNA Marker（日本TaKaRa公司），BBSⅠ酶（美國Sigma公司），T4 DNA連接酶（美國Sigma公司），DH5α感受態E.coli（日本TaKaRa公司），PrimeSTAR GXL DNA Polymeres PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），Promega DNA純化試劑盒（美國CST公司），質粒提取試劑盒（中國TIANGEN公司），Biobest轉染試劑（美國CST公司），PTEN、LC3、P62抗體（美國CST公司），CCK-8（美國Bimake公司）。

1.2 puro-cas9-PTEN-sgRNA質粒構建

1.2.1 sgRNA的設計與合成：根據sgRNA設計網站（http：//tools.genome-engineering.org），對PTEN基因1個外顯子序列進行分析，篩選出評分較高的sgRNA序列（靶點序列sgRNA1，5’-caccgTTGAGAGTTGAG CCGCTGTG-3’；……