可降解苯酚的厭氧產電菌株的分離篩選及生物學特性研究

李金達 易夢雯 王麗麗 付春娜 燕紅

摘要：以含苯酚的厭氧段污水為底物構建微生物燃料電池（microbial fuel cell，MFC），從處于穩定期的MFC陽極分離篩選獲得一株可降解苯酚的厭氧產電菌株A4.對菌株A4進行生理生化鑒定，表明該菌為腸桿菌。以菌株A4作為研究對象，探究了不同的氮源、碳源、pH值、溫度、初始苯酚濃度、接種量及重金屬離子對菌株生長同時對苯酚降解情況的影響。研究表明：最適氮源為NH₄NO₃，最佳共代謝基質為蔗糖，培養基初始pH值8，最佳初始苯酚濃度500mg/L，最適溫度為23℃，接種量為10%。菌株A4可耐受一定濃度（0.2mg/L）的Pb²⁺，而對高濃度（2000mg/L）的苯酚耐受性降低。該菌株在生長的穩定期產電，測得64h時苯酚降解率達到67.37%，庫倫效率（CE）為17.8%。研究通過選育優質的厭氧產電菌并優化其生長條件，在MFC處理含酚廢水的應用上有重要意義。

關鍵詞：苯酚降解;產電細菌;分離篩選;生物學特性;微生物燃料電池

DOI：10.15938/j.jhust.2020.02.020

中圖分類號：0643.3;Q939.9文獻標志碼：A 文章編號：1007-2683（2020）02-0146-10

0 引言

苯酚是原生質類的芳香化合物，常被用作為化工產業的原料和反應的中間體。酚類化學結構穩定難于降解，直接排放會對生物體及環境造成嚴重危害。目前處理含酚廢水的方法有物理法（吸附法、溶劑萃取法）、化學法（氧化法、沉淀法和光催化法）、生物法（活性污泥法、酶處理法）等。物理法和化學法適用于高濃度的含酚廢水，且有投資高損耗大的缺點，而生物處理法處理含酚廢水是一種低成本的環境友好型污染修復方式。近年來，微生物降解苯酚的研究中，從酚類污染的環境中篩選分離出來的苯酚降解菌有假單胞菌屬（pseudomonas 3P。）、惡臭假單胞菌（pseudomonasputida）、球形芽抱桿菌（6acillus sphaericus）、紅球菌（rhodococcus Jp。）、根瘤菌（rhizobia。）、不動桿菌（acinetobacter sP。）、睪丸酮叢毛單胞菌（comamonas testoterone）、蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus）等。

微生物燃料電池（MFC）是一種新型綠色廢水處理技術，能夠在處理廢水同時利用微生物催化將有機物中的化學能轉化成電能，從而引起了廣泛關注。目前，使用MFC降解含酚廢水的研究多集中于改變MFC的構型，而通過改變MFC的產電性能和影響苯酚降解的因素來改善電池的電壓和苯酚降解率，獲得純的可降解苯酚的產電微生物為切入點的研究較為少見。在此，考慮到厭氧生物處理法有能耗低，負荷高的優點，將含苯酚的厭氧段工業廢水樣品為研究樣品，從處于穩定期的MFC的陽極中分離純化、篩選出可高效降解苯酚的厭氧產電微生物;對其進行鑒定，并對篩選出的菌株的生長條件和苯酚降解條件進行優化，以獲得該菌株最適宜生長及苯酚降解的條件。最后應用于MFC中，從而取得更加優越的性能，也為酚類等難降解有機物的高效低耗處理提供思路。

1 材料

1.1污水樣品來源

采自黑龍江省哈爾濱市文昌污水處理廠A²/O厭氧池的污水。

1.2 培養基

富集培養基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10s/L，NaCl5g/L，苯酚500mg/L，加蒸餾水配成1000mL，pH值調至7.2-7.4.

分離培養基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，瓊脂18g/L，苯酚500mg/L，加蒸餾水配制1000mL，調節pH值至7.2～7.4.

無機鹽培養基：KH₂PO₄3g/L，Na₂HPO₄6g/L，NaCl 0.5g/L，酵母膏0.2g/L，NH₄Cl 1g/L，CaCl₂0.011g/L，FeSO₄0.025g/L，MgSO₄0.24g/L，苯酚500mg/L。

厭氧液體培養基：胰蛋白胨4.0g/L，牛肉浸膏4.0g/L，酵母膏1.0g/L，CaCl₂0.2g/L，NaCl 5.0g/L，乙酸鈉16.0g/L，FeSO₄·7H₂O 0.2g/L，MgCl₂0.2g/L，K₂HPO₄1.2g/L，半胱氨酸1.0g/L，檸檬酸鐵5.0mmol/L和刃天青0.4mL/L，調節pH值為7.

厭氧固體培養基：胰蛋白胨4.0g/L，牛肉浸膏4.0g/L，酵母1.0g/L，CaCl₂0.2g/L，NaCl 5.0g/L，乙酸鈉16.0g/L，FeSO₄·7H₂O 0.2g/L，MgCl₂0.2g/L，K₂HPO₄1.2g/L，半胱氨酸1.0g/L，檸檬酸鐵5.0mmol/L和刃天青0.4mL/L，瓊脂18g/L，調節pH值為7.

1.3 電極緩沖液

陰極緩沖液：Na₂HPO₄2.75g/L，NaH₂PO₄4.22g/L，KMnO₄200mg/L。

陽極緩沖液：NH₄Cl 1.5g/L，MgCl₂·6H₂O 0.1g/L，CaCl₂0.1g/L，KH₂PO₄0.1g/L。

3.3.2 碳源對菌株生長和苯酚降解的影響

苯酚可作為菌株A4的碳源，而外加碳源可以促進菌株生長和增強苯酚降解率，使降解時間縮短。本研究分別采用蔗糖、乳糖、葡萄糖和乙酸鈉作為外加碳源進行實驗，經48h的培養發現如圖6（a），乳糖對菌株生長促進作用最為明顯，OD60達到0.73.其次為蔗糖，OD₆₀₀為0.68.如圖6（b）所示，當添加外加碳源為蔗糖時，菌株苯酚降解率最高，可達到29.5%。可能原因是蔗糖與菌株降解苯酚具有共代謝的作用。綜合菌株的生長情況、苯酚降解率和經濟效益考慮，選擇蔗糖作為菌株對苯酚降解的最佳碳源。

3.3.3 初始pH值對菌株生長和苯酚降解的影響

培養基的初始pH值在微生物的生長及有機物的降解的過程中具有重要影響。如圖7（a）所示，隨著初始pH值增長，菌株A4的生長量呈現先上升后下降的趨勢。研究表明，菌株A4適應弱堿性的環境生長，最適合菌株生長的初始pH值為8.如圖7（b），當pH值為8.0時，菌株苯酚降解率最高，在此PH條件下培養48h，該菌株對苯酚的降解率達50%。綜上分析，選擇pH值為8作為菌株A4的最佳初始pH。

3.3.4 接種量對菌株生長和苯酚降解的影響

接種量對菌株的生長量和苯酚降解率的影響如圖8所示。隨著接種量增加，延滯期逐漸縮短，營養物質消耗率增加，苯酚降解率也隨之增大。接種量為2%一5%時，由于菌量較少，營養充足，菌株繁殖速度較快。當接種量為10%時，菌株生長量和苯酚降解效率分別為0.35和23.58%，高于接種量為1%（0.17和12.53%）、5%（0.28和21.36%）及20%（0.28和14.61%）。接種量為10%時，菌株生長量OD₆₀₀為0.35，而接種量超過10%，OD₆₀₀急劇下降，并且細菌對苯酚的降解能力也顯著減弱。原因是當接菌量較高時會形成碳源競爭，抑制菌株的繁殖，影響降解速率。綜合考慮選擇10%作為菌株A4的最佳接菌量。

3.3.5 溫度對菌株生長和苯酚降解的影響

生物法處理廢水過程中，溫度與菌體的酶活力密切相關，在適宜的溫度范圍內，微生物的生理活動旺盛，有助于提高其對有機污染物的氧化降解和合成代謝能力。由圖9可以看出，當培養溫度達到37℃時，OD₆₀₀值為1.059，生長量達到最大;但此溫度條件下，菌株對苯酚的降解率為16.82%，明顯低于23搜索點對苯酚的降解率，并且菌株的苯酚降解率隨著溫度的增加而減小。所以37℃為菌株A4生長的最適溫度，而23℃為該菌株降解苯酚的最適溫度。

3.3.6 初始苯酚濃度對菌株生長和苯酚降影響

工廠排放廢水中有時苯酚的含量過高，能否耐受高濃度的苯酚，是衡量菌株實際應用條件的重要性能指標。因此本研究針對菌株A4對高濃度苯酚的耐受性進行了研究。本實驗設置的初始苯酚濃度分別是500mg/L、1000mg/L和2000mg/L。研究表明，如圖10所示，在500mg/L的苯酚廢水中A4的生長情況最好，此時的苯酚濃度最有利于對苯酚的降解。隨初始苯酚濃度的提高，該菌株的生長明顯受到了抑制，當苯酚濃度達到2000mg/L時，該菌株對苯酚的降解能力幾乎消失，說明菌株A4不適合在較高濃度的苯酚下應用。

3.3.7 金屬離子對菌株生長和苯酚降解的影響

圖11表示4種重金屬離子Cd²⁺、Co²⁺、Pb²⁺和Cu²⁺，每種金屬離子質量濃度分別為0.01mg/L、0.02ms/L、0.05m8/L、0.1mg/L、0.2mg/L和0.4mg/L時，對菌株A4的生長量和苯酚降解率的影響。由圖11（a）看出，4種重金屬離子中，菌株對Pb²⁺的耐受能力最強，48h測得OD₆₀₀達到0.4，對Co²⁺和Cu²⁺次之，而菌株對Cd²⁺的耐受能力最弱。隨著4種重金屬離子濃度不斷增長，菌株的生長呈現出不同情況。當濃度超過0.05mg/L時，菌株對Co²⁺、Cd²⁺及Cu²⁺的耐受性隨濃度增加逐漸減弱。而菌株A4對Pb²⁺的耐受性則呈現先增長后降低的趨勢，在濃度為0.2mg/L時OD₆₀₀達到最大值。

由圖11（b）可見，Cd²⁺、Co²⁺和Pb²⁺濃度從0.01mg/L升高到0.4mg/L過程中，對苯酚降解率的抑制作用不斷增強，其中，Cd²⁺作用最為明顯，48h苯酚降解率下降了15.70%。而Pb²⁺對苯酚降解的促進作用最強，當濃度達到0.2mg/L時，菌A4對苯酚的降解效率達到最高水平。由此可以看出，菌株A4可耐受一定濃度的Pb²⁺，在高濃度的Pb²⁺（0.2mg/L）存在時，菌株A4仍保持較高的苯酚降解能力。

3.4 產電特性初步探討

3.4.1 菌株A4構建的MFC

葡萄糖（1000mg/L）和苯酚（500mg/L）作為基質，將菌株A4接種到陽極，啟動MFC，驗證菌株的產電能力。運行的結果如圖12所示。菌株A4在MFC中運行大致可以分為兩個時期，分別為電壓快速上升期和相對穩定期。啟動電壓為0.66V，經歷約125h的電壓的快速增長后，電壓趨于平穩，在124h處達到最大電壓718mV。培養基更換后，電壓快速增加，可能是由于陽極表面已經形成的生物膜在MFC中起重要作用。更換3次培養液，在157h處達到電壓相對穩定期。隨著電池的運行，電壓在穩定期的數值與峰值行的差距逐漸縮小，這可能是由于菌體自身分泌氧化還原性物質，從而有效增加了電子的傳遞速率。

陳柳柳等研究表明，葡萄糖（1000mg/L）和苯酚（200mg/L）作為燃料，MFC的庫倫效率達到7.2%。駱海萍等研究發現，利用葡萄糖（1000mg/L）和苯酚（600mg/L）作為燃料，MFC的庫倫效率可達到2.3%。范平等利用苯酚（600mg/L）為底物的MFC庫倫效率為1.47%。通過構建MFC的苯酚降解曲線直觀顯示持續降解能力。本研究結果（見圖13）表明：將菌株A4接種到含苯酚（500mg/L）MFC中，苯酚降解率隨著時間的增加而逐漸升高。在64h時苯酚降解率達到最大值67.37%，隨后出現下降趨勢的趨勢，經計算庫倫效率為17.38%。本文中菌株A4利用MFC降解苯酚，降解率較低于近幾年文獻報道的其他菌株，其可能原因是陽極室中存在其他非產電細菌，MFC運行過程中能觀察到陽極室上方有氣體的累積，有機物水解酸化導致溶液pH值降低，而該菌株較適宜在弱堿性環境中降解苯酚。而庫倫效率高于其他的以苯酚為燃料的微生物燃料電池。庫倫效率是反映MFC降解有機物用來產電部分所占的比例，庫倫效率越大，電池能量的轉化率越高。陳柳柳等利用葡萄糖（1000mg/L）和苯酚（200mg/L）作為燃料，MFC的庫倫效率達到7.2%。駱海萍等利用葡萄糖（1000mg/L）和苯酚（600mg/L）作為燃料，MFC的庫倫效率可達到2.3%。范平等僅利用苯酚（600ms/L）為底物的MFC庫倫效率為1.47%。因此，在能量轉化效率方面，利用菌株A4構建的MFC具有一定優勢。

3.4.2 菌株產電循環伏安分析

探究菌株不同生長時期的產電性，對菌株培養條件的優化具有十分重要的意義。使用循環伏安法測定菌種是否具有電化學活性，圖14為菌株A4培養的循環伏安曲線圖。含有菌株A4的曲線在穩定期有一對氧化峰和還原峰，氧化峰位于-0.7mV--0.3mV，還原峰在0.5mV～0.7mV附近，這說明該菌株具有產電活性，且菌株在穩定期產電。

3.4.3 陽極碳氈掃描電鏡分析

圖15為利用SEM觀察到的生物膜及A4菌體形態。MFC中陽極碳氈具有相互交叉的網狀結構，這種結構有利于菌株A4的附著生長，從而易于形成生物膜。圖15（c）為MFC運行300h后碳氈放大5000倍的SEM圖，陽極表面附著了大量桿狀菌體細胞，生長較為致密，為菌株A4產電能力提供了直觀證據，其細胞膜外沒有觀察到類似納米導線的的衍生結構，菌株只是與電極接觸。猜測菌株A4可能通過分泌某些氧化還原介體促進電子在微生物中進行傳遞。

4 結論

1）本研究從厭氧池的污水中利用處于穩定期的MFC陽極分離、純化、篩選出可降解苯酚的厭氧產電菌株A4，并對其進行分類鑒定為腸桿菌。

2）對菌株A4的生長和苯酚降解條件進行優化，獲得最適菌株生長及對苯酚降解的條件：NH₄NO₃為最佳氮源;最佳共代謝基質是蔗糖;最佳初始pH值為8;最佳溫度為23℃;最適接種量10%。菌株A4可耐受一定濃度（0.2mg/L）的Pb²⁺，而對高濃度（2000mg/L）的苯酚耐受性降低。

3）菌株A4在生長的穩定期產電，在優化的條件下，利用葡萄糖（1000mg/L）和苯酚（500mg/L）作為燃料構建的MFC中，最大電壓達718mV，對苯酚的降解率達到67.37%，庫倫效率為17.8%。利用該菌株構建的MFC可高效降解苯酚，同時在能量轉化效率方面也具有明顯的優勢。