鳶尾素對兔骨髓間充質干細胞成脂分化的影響

翟 羽，董科明，郭紅延，劉 翠，徐紅梅，申葉春，李金儒，梅 穩

干細胞是組織工程的種子細胞，在體外具有分化成包括成骨細胞和脂肪細胞在內等多種細胞的潛能。干細胞的分化方向是由它所處的微環境所決定的[1]。BMSCs是一種組織工程中常用的種子細胞，有多條信號通路調控BMSCs的分化[2,3]，其中Wnt/β-catenin信號通路的作用尤為重要。激活Wnt/β-catenin信號通路可促進BMSCs成骨分化并抑制其成脂分化[4]。BMSCs的成脂分化又受到多種轉錄因子的網絡調節，其中比較重要的轉錄因子包括氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ, PPARγ)和CCAAT/增強子結合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein α, C/EBPα)等[5]，而PPARγ和C/EBPα又均受到Wnt/β-catenin信號通路的調控[6]。鳶尾素是新近發現的一種由運動誘導產生的肌源性細胞因子，在棕色脂肪組織中高表達[7]。最近有研究報道，鳶尾素可促進BMSCs成骨分化[8-10]，且可抑制脂肪組織的分化、成熟[11]。但是，鳶尾素對BMSCs成脂分化的影響及其作用機制尚不清楚。因此，本研究擬以體外培養的兔BMSCs為研究對象，觀察鳶尾素對BMSCs脂向分化的影響并探討其信號機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑與儀器 3個月齡雌性新西蘭大白兔1只，購自軍事科學院軍事醫學研究院實驗動物中心。重組人鳶尾素(美國Phoenix Pharmaceuticals公司)；α-MEM培養基、高糖DMEM培養基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(美國amresco公司)；消炎痛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、普通牛胰島素、地塞米松、L-谷氨酰胺、二甲基亞砜(DMSO, 美國Sigma公司)；油紅O、異丙醇(上海國藥集團)；Trizol(美國Invitrogen公司)；Wnt10a抗體(貨號：(#sc-376028; 美國Santa Cruz公司)；BCA測定試劑盒(南京建成)；PVDF膜(美國Millipore公司)。

Herocell C1型CO2恒溫培養箱(中國潤度生物)；BCM-1000A型生物凈化工作臺(蘇州安泰)；5702R型低速離心機、Biophotometer核酸蛋白測定儀(德國eppendorf公司)；Multiskan型酶聯儀(美國賽默飛·世爾公司)；DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40型轉膜儀(六一儀器廠)；LW300LFT型正置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.2 細胞增殖能力檢測 取第2代兔BMSCs接種于96孔板，并將細胞分成2組：對照組僅采用含10%胎牛血清的α-MEM培養液培養；鳶尾素組則在α-MEM培養液中加入100 ng/ml的重組鳶尾素，劑量參考既往報道[8,11]。接種后1～11 d，每天采用MTT法檢測BMSCs的增殖活性，檢測方法參照文獻[12]。

1.3 qPCR檢測成脂相關基因的轉錄表達 將第3代BMSCs以1.0×104/孔的密度接種于24孔板，待細胞長滿瓶底面積70%時，換為自行配制的成脂誘導培養液(在高糖DMEM培養基中加入10%胎牛血清、1000 nmol/L地塞米松、10 mg/L 牛胰島素、60 μmol/L消炎痛和0.5 mmol/L IBMX)培養，同時加入0 ng/ml(對照組)或者100 ng/ml的鳶尾素(鳶尾素組)。 兩組細胞分別成脂誘導培養7、14 d后提取總RNA，再將RNA反轉錄為cDNA并進行擴增。然后，檢測PPARγ和C/EBPα等成脂相關基因的轉錄表達。擴增條件為：95 ℃預變性3 min，96 ℃變30 s，58 ℃退火30 s，73 ℃延伸45 s，擴增30個循環，最后73 ℃ 延伸10 min。基因引物由上海申工生物合成，序列見表1。

表1 成脂相關基因引物序列

注：GAPDH為內參

1.4 油紅O染色及定量分析 對照組和鳶尾素組BMSCs在成脂誘導14 d后，倒掉誘導液，PBS緩沖液漂洗干凈，10%中性甲醛固定30 min，然后進行油紅O染色并于顯微鏡下拍照。最后，用異丙醇振蕩洗脫至油紅O脂滴全部脫落，并于490 nm處測定吸光度值。

1.5 Western blot檢測Wnt10a的表達 對照組和鳶尾素組BMSCs在成脂誘導7 d后，依據Western blot實驗的常規步驟[13]裂解細胞并提取總蛋白，凝膠電泳分離蛋白、轉膜、顯影后，采用Image J軟件分析膠片灰度。

2 結 果

2.1 鳶尾素對BMSCs增殖活性的影響 BMSCs的增殖曲線呈S形，細胞在前5 d增殖緩慢，第6～7天增殖最快，此后細胞生長處于平臺期。而鳶尾素對BMSCs增殖無明顯影響(圖1)，表明鳶尾素無細胞毒性。

2.2 鳶尾素對BMSCs成脂相關基因表達水平的影響 qPCR檢測結果顯示：在BMSCs成脂分化的第7天，與對照組相比，鳶尾素明顯抑制成脂相關基因PPARγ[(0.20±0.06)vs(1.00±0.10)]和C/EBPα[(0.40±0.06)vs(1.00±0.12)]的轉錄表達(P<0.05)；甚至在BMSCs成脂分化的第14天，鳶尾素仍能顯著抑制PPARγ[(0.61±0.06)vs(1.00±0.15)]和C/EBPα[(0.70±0.09)vs(1.00±0.18)]的轉錄表達(P<0.05)。

圖1 BMSCs增殖曲線

2.3 鳶尾素對BMSCs成脂分化的影響 對各組BMSCs成脂誘導14 d后行油紅O染色，對照組細胞中可見大小混合型的脂滴布滿整個視野，而鳶尾素組細胞中脂質沉積明顯減少。進一步對細胞中的油紅O進行半定量分析，結果也證實鳶尾素組油紅O的OD值顯著低于對照組，差異有統計學意義[(0.45±0.05)vs(0.95±0.10)；P<0.05]。

2.4 鳶尾素對Wnt10a蛋白表達的影響 Western blot結果顯示：在BMSCs脂向分化的過程中，鳶尾素能顯著提高Wnt10a蛋白的表達水平，與對照組相比差異有統計學意義[(5.01±0.78)vs(1.00±0.25)；P<0.05]。

3 討 論

本研究以兔BMSCs為細胞模型，發現在BMSCs成脂分化的過程中，鳶尾素能顯著提高Wnt10a信號蛋白的表達，進而下調成脂相關基因PPARγ和C/EBPα的轉錄表達，并最終抑制BMSCs成脂分化。

運動是預防肥胖和代謝性疾病的有效策略，不僅僅是因為運動能直接增強骨骼肌的強度，而且運動能誘導骨骼肌產生肌源性細胞因子，例如鳶尾素、白細胞介素-15和成纖維細胞因子21等[14]。這些細胞因子通過內分泌或旁分泌等方式調節機體的代謝，對機體器官的代謝紊亂起到間接的保護作用。因此，肌源性細胞因子是聯系骨骼肌和機體其它系統的重要紐帶[15]。鳶尾素是運動誘導骨骼肌產生的一種非常重要得細胞因子，它依賴激活PGC1α起作用[16]。分泌型鳶尾素的主要功能是通過上調解偶聯蛋白1(UCP1)的表達，促進白色脂肪棕色化[7]，進而通過增加能量代謝來緩解代謝性疾病[17]。例如，有研究表明，鳶尾素能通過減少脂肪酸合酶的生成抑制人脂肪細胞內脂質的沉積[18]。本研究發現，鳶尾素能抑制BMSCs成脂分化。這間接地佐證了干細胞分化平衡理論，即促進干細胞向成骨細胞分化就會抑制干細胞向脂肪細胞分化，因為鳶尾素能促進BMSCs向成骨細胞分化已被廣泛證實[8-10]。與本研究相似，有實驗表明，鳶尾素也能抑制成熟的脂肪細胞分化[19]。

經典的Wnt信號通路是調控成骨與成脂的重要信號通路[20]。有研究報道稱，鳶尾素可以通過下調sclerotin(一種Wnt/β-catenin信號通路的特異性抑制劑)來促進骨生成與礦化[21]。本實驗發現，在抑制BMSCs成脂分化的過程中，鳶尾素能促進Wnt10a的合成。當然，在經典Wnt信號通路還存在其它配體，如Wnt10b和Wnt6等，未檢測鳶尾素對其它配體表達的影響是本實驗的一個局限性。Wnt信號通路調控成脂關鍵轉錄因子PPARγ，C/EBPα和脂肪酸結合蛋白4(fatty acid binding protein 4, FABP4)的表達，PPARγ和C/EBPα主要調控成脂早期的細胞分化，而FABP4主要調控成脂末期的細胞分化。本實驗發現，無論在成脂早期(7 d)還是終末期(14 d)，鳶尾素都能顯著抑制PPARγ和C/EBPα的轉錄表達。新近有研究表明[11]，無論是內源性還是外源性的鳶尾素均能抑制脂肪組織的成熟、分化，并且鳶尾素的抑制作用與激活Wnt信號通路相關，這與本研究的結果一致。

鳶尾素是纖維連結蛋白Ⅲ型域包含蛋白5(type III domain-containing protein 5, FNDC5)的分泌形式，FNDC5體內超表達可以顯著升高循環中鳶尾素的水平[22]，而直接在BMSCs中超表達FNDC5能否抑制其自身成脂分化值得進一步探討。本研究未進行劑量-反應實驗，因此并不清楚其它干預劑量的鳶尾素對BMSCs成脂分化的影響，后續研究應設計多個干預劑量。

綜上所述，本研究發現鳶尾素能夠在體外抑制兔BMSCs脂向分化，并且鳶尾素的這種作用與激活Wnt信號通路有關。鳶尾素有望被開發成抑制BMSCs脂向分化，進而促進BMSCs成骨分化的一種新型藥物。