多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗患者血清miRNA差異表達及二甲雙胍干預作用

王晨曄，丁彩飛

（浙江省中西醫結合醫院 生殖醫學科，浙江 杭州 310003）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種以持續排卵障礙、高雄激素血癥為特征的生殖內分泌紊亂性疾病。其發病率為6%～9%[1]，且50%～80%為多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗（polycystic ovary syndrome-insulin resistance，PCOS-IR）患者[2]。IR是一種多因性疾病，目前其發生機制尚未完全探明，多認為與遺傳[3]、基因多態性[4-5]等因素密切相關。PCOS-IR患者多采用胰島素增敏劑治療，其中使用最廣泛的為二甲雙胍[6]，但二甲雙胍改善IR的機制尚不十分明確。本研究采用微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）基因芯片技術聯合定量RT-PCR的方法，篩選PCOS-IR患者血清差異性表達miRNA變化，并對其進行靶基因預測及靶基因功能富集分析，同時研究二甲雙胍干預后miRNAs的表達。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2017年5月浙江省中西醫結合醫院生殖醫學科就診且符合試驗條件者進行研究。其中確診PCOS-IR患者6例為治療組，年齡（28.7±3.3）歲；健康育齡期女性6例為健康對照組，年齡（29.2±3.9）歲。上述2組研究對象，于組內按隨機數字表法各分為：基因芯片組3例和驗證組3例。PCOS-IR治療組于二甲雙胍治療前后、健康對照組入組后，均空腹采集10 mL受試者血清，-80 ℃保存備用，基因芯片組用miRNA基因芯片、驗證組用RT-PCR檢測。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 診斷標準 PCOS的診斷采用2003年鹿特丹標準[7]：①稀發排卵或無排卵；②臨床高雄激素血癥表現和（或）生化高雄激素血癥；③至少一側≥12個直徑2～9 mm的卵泡，和（或）卵巢體積＞10 cm3。 與上述2 項相符并將其他因素誘發的高雄激素血癥排除便可確診。根據全國糖尿病防治組測算的采用胰島素抵抗的穩態模型（homeostasis model assexxment-insulin resistcmce，HOMA-IR）[空腹胰島素（fasting insulin，FINS，mU/L）×空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG，mmol/L）]/22.5）＞2.69判定為IR[8]。納入標準：①符合診斷標準；②年齡20～40歲；③可配合治療。排除標準：①其他引起排卵障礙的疾病者，如高泌乳素血癥、卵巢早衰、垂體或下丘腦性閉經等；②器質性疾病或其他內分泌疾病；③合并有肝腎、腦血管、心血管和造血障礙等原發性疾病及精神病患者；④近3個月內服用過激素類藥物如避孕藥、糖皮質激素、胰島素增敏劑者及已知的干擾性激素分泌和新陳代謝的藥物，或參加其他臨床試驗的患者。

1.3 治療方法 PCOS-IR治療組：在月經來潮或撤藥性出血后第1天開始早、中、晚餐中口服0.5 g鹽酸二甲雙胍片（格華止，中美上海施貴寶制藥有限公司），每天3 次，治療療程3 個月。健康對照組：不予任何藥物治療。

1.4 miRNA基因芯片檢測

1.4.1 試劑：RNA抽提試劑Invitrogen TRIzol（Cat.15596026）購自美國Invitrogen公司；RNA Later@RNA inhibitor、反轉錄酶SuperscriptTMIII reverse transcriptase購自美國Life Technologies公司；DNase、Easy Dilution和SYBR Green Premix Ex Taq II購自日本TaKaRa生物工程有限公司；Cy3-dCTP購自美國PerkinElmer公司；人miRNA表達譜芯片由美國LC Sciences公司提供（miRBase 21.0）。

1.4.2 總RNA提取純化、芯片雜交、芯片數據分析：血清總miRNA的提取采用TRIzol試劑抽提，用超微量分光光度計Nano-drop1000測定吸光度值（D），抽提所得總RNA經Ag-ilent 2100 bioanalyzer（購自美國Agilent科技有限公司）電泳質檢合格后使用miRNeasy迷你試劑盒（購自德國QIAGEN公司）獲得，并采用紫外吸收測定法及變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性，純化總RNA。采用miRCURYTM Array power標記試劑盒，用標記酶將Hy3TM或Hy5TM熒光基團標記miRNA，以得到用于芯片雜交的熒光探針。在標準條件下使用PhalanxTM的熱收縮雜交袋將標記好的探針和miRCURYTM芯片雜交后，采用GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片的熒光強度，再轉化為原始數據后使用配套軟件進行LOWESS過濾歸一化處理以及差異表達分析，得出差異性表達的miRNA。

1.4.3 實時RT-PCR驗證基因芯片顯示的差異性表達的miRNA：通過使用莖-環的反義引物混合物和AMV轉錄酶（大連TaKaRa公司）驗證。所有的引物從昆明沃森生物科技公司購買，基于森格研究所公布的miRNA序列。

1.4.4 生物信息學分析：RT-PCR驗證得到的顯著差異性miRNAs，使用TargetScan、miRanda兩款軟件對顯著性差異的miRNA分別進行靶基因預測，取此兩款軟件的交集作為差異miRNA的最終靶基因。差異miRNA靶基因預測的最后結果中顯示miRNA對應的靶基因信息，并且對靶基因進行Gene Ontology（簡稱GO）和KEGG功能富集分析。

1.5 統計學處理方法 采用SPSS20.0統計軟件分析數據。計量資料以 ±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清芯片檢測結果 與健康對照組比，PCOSIR治療組治療前有13個miRNA基因表達上調，6個miRNA基因表達下調，差異有統計學意義（P＜0.05）；PCOS-IR治療組治療前與健康對照組差異聚類分析圖，見圖1。與PCOS-IR治療組治療前比，PCOS-IR治療組治療后有3個miRNA基因表達上調，13個miRNA基因表達下調，差異有統計學意義（P ＜0.05）；PCOS-IR治療組治療前和治療后聚類分析，見圖2。

2.2 特異性表達miRNA靶基因預測結果 PCOS-IR患者與健康對照組比較：hsa-miR-4472有3 755個靶基因、rrv-miR-rR1-7-5p有2 704個靶基因、hsa-miR-4433a-3p有4 206個靶基因、hvt-miR-H17-5p有486個靶基因、hsa-miR-5195-3p有2 871個靶基因、hvtmiR-H16-5p有2 010個靶基因、hsa-miR-6752-5p有3 293個靶基因、hsa-miR-4649-5p有827個靶基因、hsa-miR-4433b-3p有2 162個靶基因、hsa-miR-4463有2 013個靶基因。PCOS-IR患者二甲雙胍治療組治療后與治療前比較：hsa-miR-3620-5p有3 334個靶基因、rrv-miR-rR1-7-3p有486 個靶基因、rrvmiR-rR1-7-5p有253個靶基因、mghv-miR-M1-11-5p有2 204個靶基因、hsa-miR-6740-5p有2 313個靶基因、hsa-miR-148a-3p有2 880個靶基因、hsa-miR-7110-5p有3 331個靶基因、hsa-miR-29a-3p有2 707個靶基因。

圖1 PCOS-IR治療組治療前和健康對照組聚類分析圖

圖2 PCOS-IR治療組治療前和治療后聚類分析圖

2.3 差異表達基因的GO富集分析 GO總共有3個ontology（本體），分別描述基因的分子功能（molecular function）、細胞的組成成分（cellular component）、參與的生物過程（biological process）。GO分析顯示：差異表達基因與轉錄調控、信號轉導、跨膜轉運、細胞增殖、細胞凋亡、細胞代謝、細胞黏附、蛋白磷酸化、蛋白質運輸、多細胞生物發育、凝血功能、神經傳導等有關。

2.4 差異miRNA靶基因KEGG富集性分析 KEGG通路富集分析結果表明，差異表達miRNA參與顯著表達的通路有：EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性、Rap1信號通路、Wnt信號通路、前列腺癌通路、mTOR信號通路、cAMP信號通路、磷脂酰肌醇信號系統、MAPK信號通路，見圖4。

圖3 篩選出的miRNA靶基因對應的GO注釋圖

圖4 差異miRNA靶基因KEGG富集分析圖

3 討論

PCOS的發病機制尚不十分清楚，目前研究證實PCOS發病主要與高雄激素血癥、炎癥免疫過度激活及遺傳易感性[2-3]有關，常伴有不同程度的IR和代償性高胰島素血癥[2]。二甲雙胍是胰島素增敏劑，被廣泛用于治療PCOS-IR患者，其作用機制尚不明確。本研究采用miRNA基因芯片技術聯合定量RTPCR的方法，篩選PCOS-IR差異性表達的miRNA，及二甲雙胍干預后miRNA的表達變化，并進行靶基因預測及靶基因功能富集分析。

本研究PCOS-IR治療組治療前與健康對照組差異miRNA聚類分析結果可以看出，miRNA可以有效區分2組樣本。PCOS-IR治療組治療前與治療后差異聚類分析結果可以看出，miRNA的表達在二甲雙胍治療前后發生了變化。然而，這些明顯變化的miRNA 通過調控哪些靶基因而起作用還不十分明了。通過RT-PCR驗證，PCOS-IR治療組治療前與健康對照組之間，得到10個差異表達變化的miRNA；PCOS-IR治療組治療前與治療后之間，得到8個差異表達變化的miRNA。本次研究中miRNA的變化與前期的研究之間重疊的僅miR-29-3p和miR-4463，考慮這可能是由于來源于不同類型PCOS（PCOS和PCOS-IR）患者[9]。 近期關于下肢動脈硬化閉塞癥的研究報道提出：miR-4463預測靶基因與細胞極性和遷移、細胞的緊密連接、脂質代謝、內吞作用、血管平滑肌收縮等功能相關，KEGG pathway分析則發現他們可能參與了胰島素信號通路、PI3K-Akt信號通路、AMPK信號通路、mTOR信號通路等，這與我們研究結果基本一致[9]。miR-29-3p是人體細胞生長和增殖調節的重要miRNAs，上皮性卵巢癌組織中miR-29-3p表達上調并可能發揮促癌作用[9]。GLUT4的表達也受miR-29-3p控制，它們可直接或間接調節GLUT4的表達從而參與糖尿病的發生與發展[9]。

在靶基因的預測方面，使用TargetScan、mi-Randa兩款軟件對顯著性差異的miRNA分別進行靶基因預測，以此來探索PCOS-IR的發病機制及二甲雙胍干預機制，篩查出的可能靶基因41 835個，其中PCOS-IR與正常對照組間預測到靶基因24 327個；PCOS-IR治療前后預測到靶基因17 508個。GO是一個國際標準化的基因功能分類體系，提供了一套動態更新的標準詞匯表（controlled vocabulary）來全面描述生物體中基因和基因產物的屬性。其中差異表達基因的GO富集分析發現：差異表達基因與轉錄調控、信號轉導、跨膜轉運、細胞增殖、細胞凋亡、 細胞代謝、細胞黏附、蛋白磷酸化、蛋白質運輸、多細胞生物發育、凝血功能、神經傳導等有關。

在生物體內，不同基因相互協調行使其生物學功能，基于Pathway的分析有助于更進一步了解基因的生物學功能。KEGG是有關Pathway的主要公共數據庫，Pathway顯著性富集分析以KEGG Pathway為單位，應用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在顯著性差異表達基因中顯著性富集的 Pathway。在差異miRNA靶基因KEGG富集性分析過程中，通過將這些基因與對PCOS-IR的發生和二甲雙胍治療密切相關的信號通路基因相交集，最后得到與PCOS-IR和二甲雙胍治療相關性更大的miRNA的靶基因。表達顯著的通路有：EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性、Rap1信號通路、wnt信號通路、前列腺癌通路、mTOR信號通路、cAMP信號通路、磷脂酰肌醇信號系統、MAPK信號通路。匹配到單個通路的具有顯著性差異的基因數：EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性61個基因、Rap1信號通路145個基因、wnt信號通路103個基因、前列腺癌67個基因、mTOR信號通路110個基 因、cAMP信號通路140個基因、磷脂酰肌醇信號系統75個基因、MAPK信號通路177個基因。通過這種方法，縮小了查找范圍，共得到878個與PCOS-IR及其二甲雙胍治療更相關的靶基因。

通過文獻挖掘發現：實驗結果預測靶基因功能涉及多種疾病，包括肺癌、前列腺癌、子宮內膜異位癥、子宮內膜癌、卵巢癌、脂肪肝。可見PCOS-IR的發病機制除了特定的基因改變外，還與胰島素相關的信號通路如：mTOR信號通路、磷脂酰肌醇信號通路、MAPK信號通路密切相關[10]。此外wnt信號通路的發現，推測wnt信號通路異常可能是PCOS-IR患者子宮內膜增生、子宮內膜癌和卵巢癌高危的可能機制[11]。PCOS患者的cAMP信號通路與促進睪酮生成、肝臟脂肪變性和葡萄糖穩態密切相關[12]。EGFR酪氨酸激酶抑制劑抵抗、Rap1信號通路和前列腺癌通路在本病中的發現進一步證實二甲雙胍除了改善葡萄糖代謝外，還被證明在抗腫瘤如肺癌等腫瘤的可能作用機制[13-14]。

綜上，本研究報告了非侵入性血清miRNA譜區分PCOS-IR患者和健康對照者，以及二甲雙胍治療前后miRNA的變化，肯定miRNA參與PCOS-IR的發病和二甲雙胍治療過程，并通過生物信息學方法縮小了miRNA靶基因的查找范圍和功能分析，為PCOS-IR的發病和二甲雙胍治療機制的認識提供了依據，為今后PCOS-IR治療靶點選擇提供新的思路。