結直腸癌組織浸潤免疫細胞組成及特征

吳林峰，孫永吉，葉樂樂，沈賢，薛向陽，沈淑蓉

（1.溫州市中西醫結合醫院 腫瘤科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫科大學 第一臨床醫學院，浙江 溫州 325035；3.溫州醫科大學 基礎醫學院 微生物學與免疫學教研室，浙江 溫州 325035；4.溫州醫科大學附屬第二醫院 胃腸外科，浙江 溫州 325027）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是最常見的腫瘤之一，在全球因癌癥死亡的原因中居第二位[1]。隨著醫療水平的提高，盡管癌癥的存活率得到了極大的提高，但CRC的發病率及病死率仍較高，晚期患者的預后仍然很差[2]。腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）的免疫特征已經被列入腫瘤十大特征之一[3]，一方面能夠在患者臨床預后中發揮作用，另一方面，還能預測患者臨床化療或者放療等的臨床療效[4-5]。因此，對TME中免疫細胞的種類和分布的研究，具有重要臨床意義[6-9]。由于健康人的組織標本的獲得存在很大難度，近年來對于TME的研究通常是將癌癥患者的腫瘤組織及配對的正常組織如癌旁組織進行對比，很少有研究探討腫瘤組織與健康人組織的差異。

現階段用于TME研究的主要技術手段有免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）和流式細胞術（flow cytometry，FCM）2種，但這些技術存在局限性。IHC一次可以評估很少的免疫細胞類型，而FCM明確區分某些細胞類型通常基于幾種標記蛋白，其受熒光通道數量的限制。隨著計算機科學和互聯網技術的進步，生物信息學得到了快速的發展，各種新的生物信息分析技術不斷涌現，CIBERSORT就是其中之一[10]。CIBERSORT采用對大量基因表達數據進行去卷積的一種復雜的算法，可以將組織中基因表達譜數據轉化為組織中各種免疫細胞類型所占的比例。

本研究通過下載GEO數據庫51 例健康人以及333例CRC患者的基因表達譜數據，通過CIBERSORT工具轉化為免疫細胞類型及其占比情況。從TME角度出發，探討健康人與CRC組織在免疫細胞組成及含量上的差異，為相關研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究人群 在GEO數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載不同疾病狀態的結直腸組織樣本的基因表達譜數據，其中，CRC的數據來自數據集GSE4107（n=12），GSE21510（n=124），GSE4045（n=37），GSE25071（n=46），GSE30540（n=35），GSE32323（n=17），GSE35896（n=62），共333例；正常結直腸組織的數據來自數據集GSE4107（n=10），GSE21510（n=24），GSE32323（n=17）共51例。

1.2 免疫細胞特征 CIBERSORT轉換方法是通過CIBERSORT函數，對復雜組織（如大體積實體腫瘤）的轉錄組測序表達譜進行統計分析，通過反褶積方法去噪及去除未知混合物含量，來估計22種免疫細胞亞群的相對比例。根據每個測序樣本的表達譜數據，分析其中特異的547個基因的相對表達量來預測22種免疫細胞的占比情況。免疫細胞在健康人和CRC患者的結直腸組織中的浸潤總比例為100%，選擇P＜0.05的數據進行后續分析。見表1。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS22.0軟件進行統計分析。正態分布的連續變量數據以 ±s表示，進行t檢驗，非正態分布的連續變量數據通過非參數U檢驗進行分析；等級變量通過χ2檢驗及秩和檢驗進行分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRC與正常結直腸組織TME的特征 我們通過CIBERSORT轉換獲得51例健康人與333例CRC患者22種免疫細胞的浸潤比例。結果顯示，在健康人中，Bn、plasma cells、CD4+Tmr、Tfh、M0、M2、Ma在結直腸組織中占的比例較多，均在5%以上；Bm、CD8+T、tregs、γδT、NKr、M1、DCr、Mr浸潤占比在1%以上；CD4+Tn、CD4+Tma、NKa、Mono-cytes、DCa、eosinophils、neutrophils所占比例較少，均小于1%。在CRC患者的腫瘤組織中，plasma cells、CD4+Tmr、CD4+Tma、Tfh、M0、M1、M2、Ma在結直腸腫瘤微環境中占的比例較多，均在5%以上；Bn、Bm、CD8+T、CD4+Tn、tregs、γδT、NKr、NKa、DCr、DCa、Mr、neutrophils浸潤占比在1%以上，但小于 5%；monocytes、eosinophils所占比例較少，均小于1%（見圖1）。

2.2 CRC與正常結直腸組織浸潤免疫細胞的差異

T細胞在CRC組織中的浸潤百分數為（35.7± 13.8）%，B細胞為（14.9±10.3）%，均低于健康人的結直腸組織（P＜0.01）；macrophages、DCs、mast cells、neutrophils在CRC中的浸潤比例高于正常組織（P＜0.01）；NK cells、monocytes和eosinophils在腫瘤組織和正常組織中差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。為進一步探究免疫細胞在CRC與正常組織中浸潤的差異，我們對T細胞、B細胞、macrophages、NK cell、DCs和mast cell亞型進行分析。在T細胞亞型中，CD4+Tmr、Tfh和γδT在正常組織中的浸潤百分數明顯高于CRC組織 （P＜0.01）；CD4+Tma在CRC中浸潤程度明顯高于正常組織（P＜0.01）；CD8+T、CD4+Tn和tregs在CRC組織與正常組織中差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。在B細胞亞型中，Bn在正常組織中的浸潤比例高于CRC組織（P＜0.01），而Bm和plasma cells在2組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4。在巨噬細胞亞型中，M0、M1在CRC中浸潤的程度高于正常組織（P＜0.01），M2在CRC組織與正常組織差異無統計學意義（P＞0.05）；在CRC組織中，M2亞型在總巨噬細胞中所占比例下降（P=0.003）。見圖5。在DCs的亞型中，DCr和DCa在CRC組織的浸潤比例均高于正常組織（P＜0.01）；在NK的亞型中，NKr和NKa在腫瘤組織與正常組織間差異無統計學意義（P＞0.05）；在mast cells的亞型中，Ma在腫瘤組織的浸潤比例高于正常組織（P＜0.01），而Mr差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖6。

表1 健康人和CRC患者結直腸組織中免疫細胞占比情況

圖1 CRC與正常結直腸組織中的免疫細胞組成

3 討論

圖2 9種免疫細胞在CRC與正常組織中浸潤的差異

圖3 CRC與正常組織中T細胞亞型分析

許多研究發現，腫瘤組織浸潤的免疫細胞對于腫瘤的發生發展具有重要作用[11-12]，并影響腫瘤對治療的反應[3，13-14]。本研究通過CIBERSORT技術，獲得健康人和CRC患者的結直腸組織中浸潤的免疫細胞的情況，發現T細胞、B細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、肥大細胞、樹突狀細胞和自然殺傷細胞在2組間差異有統計學意義。我們觀察到T細胞與B細胞在CRC患者組織中的浸潤比例要低于正常組織，并且發現T細胞浸潤減少主要是因為Tfh，γδT浸潤減少，B細胞浸潤減少主要是因為Bn浸潤減少。有研究表明[15-17]，在CRC患者中，T細胞與B細胞的浸潤對患者的預后具有積極地影響，本研究進一步闡明了T細胞與B細胞在TME中的浸潤趨勢。ROHRUDILOVA等[18]對肝臟組織進行過類似的研究，發現在肝細胞癌組織中浸潤的T細胞與B細胞數量均高于正常組織，這與本研究結果存在差異。腫瘤細胞與TME間存在復雜的相互作用[19]，可能在不同的癌癥中，不同的組織中，TME也存在差異。

圖4 CRC與正常組織中B細胞亞型分析

圖5 CRC與正常組織中巨噬細胞亞型分析

圖6 CRC與正常組織中肥大細胞、樹突狀細胞和NK細胞亞型分析

腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAM）是炎癥和癌癥領域最重要的參與者之一，主要分為M1型和M2型巨噬細胞，M1型發揮抗腫瘤作用，而M2型發揮促進腫瘤生長、侵襲和轉移的作用[20]。臨床研究證實，M2型TAM浸潤的數量與腫瘤患者的預后呈負相關，腫瘤組織中的M2型巨噬細胞大量存在提示預后不良[21-22]。本研究發現，巨噬細胞在CRC患者的結直腸組織中浸潤增多，進一步分析發現，增多的免疫細胞主要是M0與M1，M2在CRC與正常人的結直腸中浸潤程度無差別，且在CRC中M2型巨噬細胞比例下降。這對于患者的預后是一個有利信號。

中性粒細胞在腫瘤組織中的浸潤百分比大于正常組織。有研究表明，在胃癌和CRC中，中性粒細胞在腫瘤組織中的浸潤程度要高于腫瘤基質[23]，提示中性粒細胞趨向在腫瘤組織中浸潤，但其研究僅將腫瘤患者的腫瘤組織與腫瘤基質對比，本研究將CRC與健康人的結直腸組織進行對比，發現在CRC患者腫瘤組織中中性粒細胞的浸潤比例較高，進一步表明在CRC組織中可能存在某種機制，促進中性粒細胞的浸潤。然而在肝細胞癌中，腫瘤患者與正常人的中性粒細胞的浸潤情況并無差別[18]，提示對于不同的類型的癌癥，TME中中性粒細胞的浸潤情況有所不同。有研究報道，在不同組織中中性粒細胞浸潤與預后的關系不同，腫瘤相關中性粒細胞（tumor-associated neutrophils，TAN）的浸潤對于頭頸癌[24]、腎細胞癌[25]、黑色素瘤[26]、肝細胞癌[27]和肝內膽管癌[28]患者的預后是一個有利因素，對于乳腺癌[29]、胃癌[30]、結直腸癌[31-32]患者是一個不利因素。

此外，本研究還發現Mr在CRC腫瘤組織與正常組織中的浸潤比例差異無統計學意義，而Ma在腫瘤組織中的浸潤比例要高于正常組織，提示肥大細胞在腫瘤組織中更趨向于活化狀態，其活化的機制尚不清楚。雖然肥大細胞有多種不同的激活方式[33]，但CIBERSORT是以IgE介導活化的肥大細胞的基因表達特征作為Ma的篩選模板[10]，即篩選出來的活化的肥大細胞均是通過IgE介導激活的。有研究表明，IgE介導的肥大細胞活化可能在抗腫瘤免疫中起重要作用[34-35]，IgE介導的免疫細胞活化也是目前免疫治療的一個重要靶點[36]。因此，CRC中IgE介導的肥大細胞活化增多可以增強機體的抗腫瘤反應，有利于抑制腫瘤生長。此外，CD4+記憶T細胞和NK細胞在CRC的TME中更趨向于活化狀態，具體機制尚不清楚。

然而在臨床中，正常人的大腸組織標本很難獲得，所以在臨床驗證方面，本研究的進一步展開目前存在一定的難度，并且當前的免疫技術對于其中許多免疫細胞的檢驗依舊存在瓶頸，例如難以準確區分各種亞型的T細胞。因此臨床驗證方面的缺失是本研究的最大遺憾，希望能在將來得以解決。

綜上，本研究通過CIBERSORT方法，分析了CRC患者和健康人大腸組織中22 種免疫細胞的浸潤情況，獲得了這些免疫細胞在兩者中的分布趨勢，其中T細胞、B細胞在腫瘤組織中浸潤較少，肥大細胞與CD4+記憶T細胞在TME中趨向于活化，希望這些發現能為相關研究提供參考與思路。