維生素B12對氧化應(yīng)激損傷下神經(jīng)細胞的保護機制

葉璐霞，徐莉菲，薛榆潔，童鶴艷，何逸昉，李校堃

（溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035）

創(chuàng)傷性腦損傷是指暴力造成的腦實質(zhì)損傷，并引起感覺、運動功能障礙[1]，甚至腦死亡等嚴重后果，具有較高病死率及致殘率。創(chuàng)傷性腦損傷后的繼發(fā)性損傷是這幾年的研究熱點，其中氧化應(yīng)激是繼發(fā)性腦損傷的重要環(huán)節(jié)之一[2]。維生素B12，作為葉酸中的輔酶，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起著重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)維生素B12的缺乏將導(dǎo)致蛋氨酸和S-腺苷蛋氨酸的合成障礙[4]。臨床上維生素B12廣泛用于治療周圍神經(jīng)損傷修復(fù)，或與其他藥物聯(lián)合使用治療其他神經(jīng)疾病等[5]。另外，最近有報道發(fā)現(xiàn)維生素B12能夠清除超氧化物來促進神經(jīng)軸突再生情況[6]。本研究通過PC12細胞運用H2O2模型來模擬腦創(chuàng)傷后的氧化應(yīng)激損傷，探討維生素B12對氧化應(yīng)激損傷神經(jīng)細胞的保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞處理及分組：高分化鼠嗜鉻細胞瘤細胞（PC12）購自中科院上海細胞中心。細胞培養(yǎng)基為RPMI 1640添加10% FBS，以及100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃，5% CO2。細胞長滿后，進行細胞鋪板，待細胞長到80%～90%后，將細胞分為對照組（Control），損傷組（H2O2），維生素B12保護組（H2O2+VitB12）。H2O2組采用200 μmol/L 的H2O2刺激，H2O2+VitB12組提前2 h給予維生素B12（200 μmol/L）預(yù)處理，以30 min作為時間間隔觀察細胞形態(tài)變化，待大量細胞發(fā)生形態(tài)改變時再進行后續(xù)實驗。

圖1 3組PC12細胞的形態(tài)、細胞增殖能力和DNA復(fù)制水平比較

1.1.2 藥品及試劑：EdU染色試劑盒購自廣州市銳博生物科技有限公司，Bcl-2、Bax和P62、ATG-5、LC3等一抗和二抗購于英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞生存率實驗：細胞長滿后，加入維生素B12提前預(yù)保護2 h，然后加入200 μmol/L H2O2誘導(dǎo)損傷，一段時間后倒掉培養(yǎng)基，加入含CCK-8的無血清培養(yǎng)基，1～4 h后用酶標儀OD 450 nm檢測細胞活性。

1.2.2 細胞損傷情況檢測：細胞處理后，用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)；或加入稀釋好的EdU溶液，孵育2 h，然后細胞固化，再加入1×Apollo?染色反應(yīng)液，避光、室溫條件下，在脫色搖床孵育30 min 后，棄染色反應(yīng)液，然后加入100 μL滲透劑（0.5% TritonX-100的PBS）在脫色搖床上清洗2～3次，每次10 min，棄滲透劑，然后加入hoechst33342反應(yīng)液，最后熒光顯微鏡檢測。

1.2.3 Western blot及免疫熒光檢測：細胞處理 后，加入裂解液，提取蛋白，然后蛋白定量，制膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉2 h，用PBST洗膜3次，每次 7 min，一抗孵育過夜，用PBST洗膜3 次，每次 7 min，二抗孵育2 h，用PBST洗膜3次，每次7 min，最后曝光；或細胞固定后，加入滲透劑，然后封閉，加入一抗孵育過夜，用PBST洗脫3次，每次5 min，避光加入熒光二抗孵育1 h，用PBST洗脫3次，每次5 min，避光加DAPI，封片，然后熒光顯微鏡檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用GraphPad Prism軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用 ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t 法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組PC12細胞形態(tài)、細胞增殖能力和DNA復(fù)制水平比較 與Control組比，H202組的PC12細胞形態(tài)為圓形，H202+VitB12組的PC12細胞形態(tài)更加飽滿，見圖1A。與Control組比，H202組的PC12細胞增殖能力較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與H202組比，H202+VitB12組的PC12細胞增殖能力較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖1B。與Control組比，H202組的PC12細胞中DNA復(fù)制水平較低，與H202組比，H202+VitB12組的PC12細胞中的DNA復(fù)制水平上升，見圖1C。

2.2 3 組PC12 細胞凋亡蛋白表達水平比較 與Control組比，H202組的Bax蛋白表達量顯著上升，Bcl-2 的蛋白表達量顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；與H202組比，H202+VitB12組Bax蛋白的表達下降，Bcl-2的蛋白表達量上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 3組自噬蛋白水平比較 與Control組比，H202組的ATG-5和LC3的蛋白表達量上升，P62的蛋白表達量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）；與H202組比，H202+VitB12組ATG-5和LC3的蛋白表達量降低，P62蛋白表達量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與Control組比，H202組的LC3熒光強度顯著上升；與H202組比，H202+VitB12組的LC3熒光強度下降。見圖3。

圖2 3組PC12細胞Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較

3 討論

創(chuàng)傷性腦損傷的病理機制非常復(fù)雜，分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷[4，7]。繼發(fā)性損傷是指血腦屏障開放后造成繼發(fā)神經(jīng)元凋亡[16]，其中氧化應(yīng)激誘導(dǎo)是重要機制之一[2]。因此本研究采用PC12細胞模擬神經(jīng)元，通過H202刺激構(gòu)建氧化應(yīng)激模型，來模擬腦創(chuàng)傷后的神經(jīng)細胞的損傷。維生素B12是臨床常用的治療神經(jīng)疾病的藥物，主要治療神經(jīng)痛、末梢神經(jīng)炎及周圍神經(jīng)病變等[9，17]，被認為具有顯著修復(fù)神經(jīng)的作用[8]，然而維生素B12用于治療腦創(chuàng)傷后的神經(jīng)損傷修復(fù)目前鮮見報道。

圖3 3組PC12細胞P62、ATG-5、LC3蛋白表達水平比較

細胞凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下，受多種基因精確調(diào)控的主動的、程序化的死亡過程，是機體重要的自穩(wěn)調(diào)節(jié)機制[12]。在眾多的凋亡調(diào)控基因中，Bcl-2 蛋白家族和胱天蛋白酶（Caspase）家族目前最受關(guān)注[13]，其中Bcl-2基因和Bax基因是目前已知的在凋亡調(diào)控過程中功能相互對立的一對最重要的調(diào)控基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)受氧化應(yīng)激的細胞表現(xiàn)出Bax蛋白表達量上升，Bcl-2下降，而維生素B12能減弱Bax蛋白表達量的上升和Bcl-2的下降，這提示維生素B12能夠有效減少損傷后凋亡信號的激活從而保護PC12細胞。細胞自噬也參與了多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，自噬與凋亡之間存在著復(fù)雜的交互調(diào)控，自噬本身也會誘發(fā)細胞死 亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，H202處理后神經(jīng)細胞中的自噬相關(guān)蛋白均被顯著激活。Western blot結(jié)果表示，損傷組的LC3、ATG-5的蛋白表達明顯上升，而維生素B12預(yù)保護能降低自噬相關(guān)蛋白的表達。免疫熒光結(jié)果同樣證實了H202誘導(dǎo)后LC3呈點狀分布在細胞質(zhì)基質(zhì)中，維生素B12預(yù)處理后能夠減少胞漿中的LC3激活。這些結(jié)果提示維生素B12能夠抑制氧化應(yīng)激后的自噬水平升高，是保護神經(jīng)細胞的另一重要原因。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶滲入正在復(fù)制的DNA分子中，它能有效反映DNA復(fù)制活性[11]。通過EdU染色結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，H202處理后發(fā)現(xiàn)，處于復(fù)制期的DNA數(shù)目較少，而維生素B12預(yù)保護后能有效提高神經(jīng)細胞DNA復(fù)制水平。這進一步提示維生素B12能夠改善氧化應(yīng)激造成的細胞損傷。

本研究顯示維生素B12能有效抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷，抑制H202對細胞凋亡的影響，進一步機制研究提示維生素B12通過調(diào)控自噬來抑制凋亡信號激活從而保護神經(jīng)細胞。本研究在信號通路方面的研究還不夠完善，比如自噬激活劑或抑制劑對神經(jīng)細胞的影響的作用，有待于深入探討。