Apelin-13通過激活ERK1/2通路復蘇布比卡因誘導的心臟停搏

王石，何玉婷，陳鄭潔，林婷婷，王權光，林麗娜

（溫州醫科大學附屬第一醫院 麻醉科，浙江 溫州 325015）

布比卡因作為局麻藥的代表藥物之一，因其起效較快、作用時間長、價格低廉等優點廣泛應用于臨床，但若用量過大或不慎入血，或機體高敏，都可能發生嚴重心臟毒性反應，致循環衰竭甚至心臟停搏[1]。APJ受體是細胞膜上的一種七次跨膜G蛋白偶聯受體，廣泛分布于全身多個重要臟器[2]。Apelin是APJ的特異性配體，作為一種多肽類物質，在反轉錄過程中可被蛋白水解酶分解為多個活性片段，其中Apelin-13是目前己知Apelin家族存在范圍最廣活性最強的片段。多年研究表明，Apelin/APJ系統有助于改善心室肥大、心力衰竭、動脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注、心律失常和冠心病等多種心血管系統的病理變化[3-5]。前期我們團隊首次發現布比卡因能抑制乳鼠心肌細胞的Apelin-13及APJ蛋白表達，且呈布比卡因濃度依賴性。因此本研究擬建立在體布比卡因心臟驟停模型，給予外源性Apelin-13處理，觀察其復蘇結局，評價Apelin-13的解救作用并探討其相關機制。

1 材料和方法

1.1 材料 健康成年SPF級雄性SD大鼠35只，體質量300～330 g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（浙）2015-0001。布比卡因（美國Sigma公司，貨號B5274-5G），Apelin-13（美國Tocris Bioscience公司，貨號217082-60-5），Apelin-13 ELISA試劑盒（上海博蘊生物公司），兔抗GAPDH單克隆抗體（美國CST公司，貨號：#5174），兔抗APJ受體多克隆抗體（美國Abcam公司，貨號ab214369），兔抗ERK1/2多克隆抗體（美國Abcam公司，貨號ab115799），兔抗p-ERK1/2單克隆抗體（美國Abcam公司，貨號ab223500），BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 構建大鼠心臟停搏模型：35 只大鼠隨機分為3組：假手術組（Sham組，n=5），布比卡因+0.9%氯化鈉溶液組（A組，n=15），布比卡因+Apelin-13組（B組，n=15）。參照文獻[6]的方法構建大鼠心臟停搏模型。實驗前禁食12 h，不禁飲。腹腔注射5%水合氯醛350 mg/kg麻醉后，行氣管切開連接呼吸機。呼吸參數設定：潮氣量6 mL/kg，呼吸頻率90～100次/min，吸呼比為2:3，FiO2100%。置入直腸溫探頭。開放右側股動靜脈置管，動脈連接生物信號采集系統，測定血流動力學指標。吸入0.5%～1.0%七氟醚維持麻醉，所有操作完成后，平衡 15 min（基礎狀態）時記錄直腸溫度、收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、心率（heart rate，HR）和收縮壓與心率乘積（rate pressure product，RPP）。停止七氟醚吸入，經靜脈20 s內注射 0.4%布比卡因30 mg·kg-1誘導心臟停搏，心臟停搏的判斷標準為平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）≤10 mmHg。心臟停搏記為零點。Sham組在麻醉下行氣管切開及股動靜脈置管，不制備心臟停搏模型。

1.2.2 復蘇方案：參照文獻[7]的方法進行復蘇。復蘇過程由3位操作者參與，大鼠心臟停跳后立即由操作者1行人工胸外按壓，直至自主循環恢復（return of spontaneous circulation，ROSC）或至40 min放棄。操作者2于零點時對B組大鼠給予150 μg Apelin-13，A組靜脈注射等量0.9%氯化鈉溶液。操作者3在復蘇期維持氣道通暢，并評估RPP指標。ROSC的判斷標準是出現規律自主心律，RPP≥20%基礎值并維持1 min以上。通過可調節保溫毯及無影燈保持直腸溫度37.5～38.5 ℃。復蘇成功的大鼠觀察至ROSC后120 min處死取心臟組織，放置液氮保存。

1.2.3 記錄大鼠復蘇結果：記錄開始給布比卡因到心臟停搏時間（T0）、心肺復蘇開始至出現第1個自主心跳的時間（Ts）和心肺復蘇開始至ROSC出現的時間（Tr）。記錄2組大鼠成功復蘇例數、120 min 復蘇期末生存例數。計算復蘇率、生存率。復蘇率=大鼠復蘇成功例數/大鼠總數；生存率=存活至120 min復蘇期末的大鼠例數/大鼠總數。

1.2.4 記錄2組大鼠的血流動力學：記錄2組大鼠ROSC后120 min內的SBP、HR、RPP，以及各時間點RPP與基礎狀態RPP的比值（RPPh）。

1.2.5 左心室組織中Apelin-13濃度測定：取20 mg 左心室組織勻漿離心取上清液，根據Apelin-13 ELISA試劑盒說明書采用雙抗體夾心原理檢測Apelin- 13濃度。

1.2.6 Western blot檢測左心室組織APJ、ERK1/2、 p-ERK1/2蛋白的相對表達量：取30 mg左心室組織加入含1% PMSF的RIPA強效裂解液，勻漿提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度并配置上樣蛋白。SDSPAGE電泳將目的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉1 h，之后用兔抗GAPDH（1:1 000）、兔抗APJ（1:500）、兔抗ERK1/2（1:1 000）、兔抗p-ERK1/2（1:1 000）等一抗4 ℃水平搖床孵育過夜，次日加入山羊抗兔IgG（H+L）HRP（1:5 000）室溫孵1 h后加入ECL發光液，用凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）自動顯影讀取條帶灰度值，以GAPDH為內參，計算目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS22.0軟件進行分析。計量資料用 ±s 表示，2組比較采用獨立樣本t 檢驗；多組比較采用單因素方差分析，方差齊性者采用LSD法，方差不齊者采用Dunnett’s T3檢驗。重復測量資料比較采用重復測量方差分析，計數資料比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠基礎值比較 3組大鼠體質量、肛溫和血流動力學指標的基礎值比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 2組大鼠復蘇結果比較 與A組比較，B組復蘇成功率和生存率升高、Tr縮短，差異有統計學意義（P＜0.05）；2組T0與Ts差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表1 3組大鼠體質量、肛溫和血流動力學指標基礎值比較（ ±s）

表2 2組大鼠復蘇情況各指標比較（n=15）

2.3 2 組ROSC后血流動力學比較 與A組比較，ROSC后20 min內B組HR明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與A組比較，ROSC后10～20 min內，B組RPP和RPPh明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；2組在ROSC后20 min內SBP差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。

2.4 3組大鼠心肌組織蛋白表達量比較 與Sham組比較，A組心肌Apelin-13、APJ、p-ERK1/2蛋白表達下調，差異有統計學意義（P＜0.05）；與A組比較，B組心肌Apelin-13、APJ、p-ERK1/2蛋白表達上調，差異有統計學意義（P＜0.05）；3組間ERK1/2蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

3 討論

布比卡因所致的心臟驟停一直是棘手且危急的臨床情況，常規復蘇非常困難，病死率高，近幾年來越來越多的研究報道脂肪乳劑是解救布比卡因心臟毒性的特效藥，但大劑量的輸注脂肪乳劑帶來的不良反應[8]使我們迫切地尋找其他更安全的藥物來有效處理這一緊急情況。目前在解救布比卡因心臟毒性研究領域上，至今無其他團隊報道Apelin-13在其中發揮的作用。本研究制備大鼠布比卡因心臟停搏模型，給予外源性Apelin-13 處理，結果表明Apelin-13可以加快達到ROSC時間，加快大鼠血流動力學恢復，提高復蘇成功率和生存率，證實了Apelin-13可有效解救布比卡因心臟毒性。這提示Apelin-13有望成為解救布比卡因心臟毒性新的特效藥，給臨床提供了新的指導意義。

圖1 2組大鼠ROSC后血流動力學情況

表3 3組大鼠心肌組織Apelin/APJ及ERK1/2通路蛋白表達量比較（n=5， ±s）

Apelin-13可啟動Apelin/APJ系統，在中樞和外周發揮正性肌力[9]、調節血壓[10]、促進血管生 成[11]等作用。而本研究結果顯示，與Sham組比較，A組心肌組織的內源性Apelin-13及APJ蛋白的表達下降，驗證了前期的心肌細胞實驗，說明了布比卡因也許通過抑制Apelin/APJ系統的表達發揮心臟毒性。眾所公認，細胞外調節蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase 1/2，ERK1/2）通路是經典的正性肌力通路[12]，作為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）家族的一個重要成員，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其中特定蘇氨酸殘基和酪氨酸殘基被磷酸化后則ERK1/2分子激活，從而發揮其生物學效應。越來越多的研究表明Apelin/APJ系統在心血管系統的 保護作用與激活ERK1/2蛋白磷酸化息息相關。YIN等[13]發現Apelin-13可通過激活ERK1/2信號通路促進H9C2心肌細胞增殖。ROSTAMZADEH等[14]報道Apelin可通過激活ERK1/2磷酸化發揮正性肌力及重塑心肌病理結構作用，有助于改善腎性高血壓所致心力衰竭。PERJES等[15]報道Apelin可通過激活ERK1/2磷酸化從而產生正性肌力、正性傳導和正性頻率作用。本研究結果顯示，與A組相比較，B組可上調大鼠心肌中Apelin-13、APJ及p-ERK1/2表達，但不影響ERK1/2表達，說明Apelin-13啟動Apelin/APJ系統，激活ERK1/2磷酸化從而發揮其解救作用。

綜上所述，Apelin-13 可解救布比卡因誘導的大鼠心臟停搏，其機制可能與激活ERK1/2通路蛋白磷酸化有關。