急性腎損傷miR-34a、GPS2表達變化及其對JNK通路的影響

陳偉偉，王德選，沈猛，莊捷秋，蔡暉

（溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院，浙江 溫州 325027，1.腎內科；2.兒童腎內科）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是一種臨床常見危重病，由多種病因造成腎功能在短期內急性減退[1]。由不同病因（如缺血、炎癥、毒素等）導致的急性腎小管壞死（acute tubular necrosis，ATN）是最常見的AKI之一。國內外對常見ATN演變方向的干預研究還處于探索階段[2]。因此在AKI后至纖維化的過程中找到新的治療靶點顯得尤為重要。

近年來，針對各類microRNAs在腎臟疾病中的表達譜研究很多，許多microRNAs被證明與AKI密切相關[3]。在AKI中，腎小管上皮細胞會過度表達miR-34a，參與調控腎纖維化和腎損傷[4]。G蛋白途徑抑制因子2（G-protein pathway suppressor 2，GPS2）是G蛋白-MAPK途徑的調節蛋白之一，它參與細胞骨架構建、DNA修復、炎癥反應等體內多種生理病理過程。本課題組在動物實驗中發現上述指標在腎缺血再灌注損傷中均出現顯著的變化，但兩者是否存在關聯，有無存在通路蛋白的變化，以及干預后是否影響AKI后進入纖維化的進程尚無定論，為此本研究進行深入探索。

1 材料和方法

1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠30只，12周齡，體質量250～300 g，無固定病原級，由北京維通利華實驗動物技術有限公司（浙江嘉興平湖基地）提供，飼養于溫州醫科大學實驗動物中心，常規飼料和自來水按時無限制供應，動物許可證號：SCXK（浙）2018-0001。TNF-α、TGF-β ELISA試劑盒及引物由上海博蘊有限公司提供；HEK 293T細胞株由中華細胞庫提供；miR-34a inhibitor、NC inhibitor、轉染試劑均購自廣州銳博公司；TB Green?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）和PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）購自大連Takara公司；GPS2等兔多克隆抗體來自美國Abcam公司；p-SPAK/JNK、 t-JNK、Beta-Actin等多克隆兔抗為美國Cell Signal Technology產品；二抗來自美國Jackson ImmunoResearch公司。其余試劑均為市售分析純。

1.2 動物實驗

1.2.1 動物分組與模型構建：30只SD大鼠喂養普通飼料適應1周后，隨機分6組，為灌注對照0 h、24 h、 48 h組和灌注模型0 h、24 h、48 h組。大鼠注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后采用腹部切口暴露雙側腎蒂，模型組采用無損傷動脈夾夾閉腎蒂 25 min后開放灌注[3]，缺血后腎臟呈現均一紫紅色，移除動脈夾腎臟紫色消失，判斷缺血再灌注成功。對照組開腹游離腎蒂不做夾閉，25 min后各組大鼠腹腔逐層縫合切口。手術過程大鼠置于恒溫電熱毯上維持37 ℃，等待麻醉藥過后蘇醒，觀察大鼠反應存活情況，待確認存活后再將大鼠放回籠中。

1.2.2 標本采集：各組大鼠開腹前經股靜脈取血2 mL，以測定造模前大鼠血清中TNF-α、TGF-β水平。造模成功后，按照灌注時間后將大鼠麻醉，獲取血液和腎臟標本。取血后以3 000 r/min離心10 min，留取上層血清保存于-80 ℃冰箱，用于檢測炎性及纖維化因子指標。離斷下腔靜脈，經左心室灌注0.9%氯化鈉溶液，腎臟變白后取下腎臟，1/3腎臟組織放在4%組織細胞固定液固定，用于形態學觀察；剩余腎臟組織保存至液氮中，用于后續mRNA和蛋白的檢測。對照組同時間點標本采集同上。

1.2.3 血清TNF-α、TGF-β水平檢測：依照ELISA試劑盒說明步驟進行檢測。

1.2.4 腎組織形態學觀察：取4%組織細胞固定液固定腎臟組織24 h后，脫水、石蠟包埋、切片（3 μm）， 制成石蠟切片，HE染色，置于顯微鏡下（×400）觀察腎小管上皮細胞形態。

1.3 細胞培養、轉染與模型構建 人胚胎腎小管上皮細胞系（HEK 293T）培養在含10%胎牛血清的DMEM培養液中，常規添加100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL 青霉素，培養箱條件為5% CO2，37 ℃，每2～3 d更換培養液。取對數生長期細胞于超凈臺下進行細胞分組，對照組（Control、NC inhibitor）和缺氧/復氧誘導AKI細胞模型組（Model、Model+miR-34a inhibitor）。將5×105個/mL密度細胞接種在24孔板中，正常培養，待細胞生長至50%～60%密度時，以100 nmol/L的終濃度在對應小組中轉染NC inhibitor 及miR-34a inhibitor，轉染48 h后，將模型組放在去血清和葡萄糖培養基中24 h，然后放入1% O2、94% N2、5% CO2缺氧條件下誘導6 h，再更換成完全培養基后放入5% CO2、95%空氣條件下復氧30 min[5]， 對照組置于5% CO2、95%空氣條件下的培養箱中30 h 30 min，收集細胞進行下一步操作。

1.4 RT-qPCR檢測miR-34a、GPS2 mRNA水平 用TRIzol裂解組織/細胞，氯仿、異丙醇萃取后離心，70%乙醇漂洗2次，20 min室溫揮發、加DEPC水等步驟提取總RNA，測定RNAs濃度，依照反轉錄試劑盒說明反轉錄成cDNA。按照各組cDNA加1 μL+DEPC水 3.2 μL+前向引物0.4 μL+后向引物0.4 μL+TB Green 5 μL=10 μL體系加樣，復孔3個，熱循環進行PCR反應。條件如下：95 ℃初始變性30 s，40個循環（95 ℃下5 s，60 ℃下30 s），融解階段（95 ℃ 下15 s，60 ℃下30 s，95 ℃下15 s），置于羅氏PCR儀上檢測。以上實驗重復進行3次。選擇U6和GAPDH作為內參，按照2-ΔΔCT計算各基因相對表達量。引物序列：U6-qPCR-F：CTCGCTTCGGCAGCACA，U6-qPCR-R： AACGCTTCACGAATTTGCGT；miR-34a F-5P-qPCR-F：ACA CTCCAGCTGGGTGGCAGTGTCTTAGCT，miR-34a R-5PqPCR-R：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGA CAACCAG；Rat-GAPDH-qPCR-F：GCAAGTTCAACGGCACAG， Rat-GAPDH-qPCR-R：GCCAGTAGACTCCACGACAT；Rat-GPS2-qPCR-F：AGTACCTCTGAGCTCCCACTT，Rat-GPS2- qPCR-R：CATGGCGTTGGAAAGCTTGG；Human-GAPDHqPCR-F：AAGAAGGTGGTGAAGCAGG，Human-GAPDH-qPCRR：GTCAAAGGTGGAGGAGTGG；Human-GPS2-qPCR-F： AGTGACCTGACCACCCTAACA，Human-GPS2-qPCR-R：CCT GGGCGATTGTGTCCTC。

1.5 Western blot檢測GPS2、p-JNK蛋白表達 用RIPA裂解液裂解腎臟組織和細胞，冰上靜置30 min 后超聲裂解，4 ℃下12 000 r/min離心20 min留取上清液。配平各組蛋白濃度，各加入預熱的5× Loading Buffer。37 ℃水浴30 min用于檢測GPS2，actin，100 ℃煮沸5 min用于p-JNK蛋白檢測。每孔加入30 μg蛋白樣品進行10%聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳，濃縮膠電壓80 mV，分離膠電壓120 mV。

冰浴下100 V恒壓半干式轉膜，轉膜時間根據蛋白分子量設置60 min到150 min不等。依次孵育一抗（多克隆兔抗GPS2抗體1:1 000；多克隆兔抗JNK抗體1:1 000；多克隆兔抗Beta-Actin抗體1:1 000，4 ℃搖床孵育過夜）、二抗（HRP標記山羊抗兔二抗1:7 000，水平搖床上室溫孵育60 min），ECL顯色。使用凝膠圖像處理系統對目的條帶進行量化分析。以上所有實驗重復4次。

1.6 統計學處理方法 采用SPSS22.0、ImageJ和GraphPad軟件進行數據分析、制圖。計量資料以 ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊性采用LSD檢驗，方差不齊采用Dunnett T3檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠缺血再灌注不同時間段腎小管細胞形態結構改變 對照組（0 h、24 h、48 h）腎小管上皮細胞結構正常，腎小球及腎小管未見明顯異常改變（見圖1A、C、E）；與同時段對照組相比，模型組發生不同程度的損傷，0 h時腎小管上皮細胞腫脹，管腔擴張，刷狀緣消失；24 h時腎小管結構排列紊亂、松散，間質部分狹窄和炎性細胞浸潤；48 h時除上述變化外，還可見到蛋白管型增多（見圖1B、D、F）。

圖1 相差顯微鏡觀察缺血再灌注不同時間腎小管細胞形態結構改變（× 400，箭頭示腎小管細胞空泡化、刷狀緣消失、炎性細胞浸潤及蛋白管型增加）

2.2 大鼠缺血再灌注不同時間段炎癥及纖維化指標變化 與對照組（0 h、24 h、48 h）比較，模型組同時段TNF-α、TGF-β表達水平顯著升高（均P＜0.01）；與造模前相比，模型組造模后各時段TNF-α、TGF-β表達水平明顯升高，差異有統計學意義（均P＜0.01），TNF-α、TGF-β表達在24 h達到最高峰（P＜0.01）。見表1。

2.3 大鼠缺血再灌注不同時間段miR-34a、GPS2 mRNA表達變化 PCR結果顯示：對照組0 h和模型組0 h時的miR-34a mRNA水平和GPS2 mRNA水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。與對照組24 h和 48 h比較，模型組相應時段miR-34a mRNA水平明顯升高（均P＜0.01），GPS2 mRNA水平顯著下降（均 ＜0.01），隨著灌注時間延長，miR-34a mRNA水平呈增加趨勢，而GPS2 mRNA水平呈下降趨勢（均P＜0.01），見圖2。

圖2 大鼠缺血再灌注不同時段miR-34a、GPS2 mRNA水平變化

表1 大鼠缺血再灌注不同時間段TNF-α和TGF-β水平變化（每組n=5，±s，ng/L）

2.4 大鼠缺血再灌注不同時間段GPS2、p-JNK蛋白表達變化 Western blot顯示：與各自對照組比較，模型組GPS2蛋白表達下降，p-JNK蛋白表達升高，差異有統計學意義（均P＜0.05）；灌注時間在48 h時，GPS2表達下降及p-JNK表達升高最顯著（P＜0.01），見表2。

2.5 HEK 293T應用miR-34a inhibitor后miR-34a、GPS2 mRNA水平 PCR結果顯示：對照組（Control）與陰性對照組（NC inhibitor）之間miR-34a、GPS2 mRNA水平差異無統計學意義（P＞0.05）；與Control 組和NC inhibitor組相比，Model組的miR-34a上調，GPS2 mRNA水平下降，差異有統計學意義（均P＜0.05）；與Model組比，沉默miR-34a基因后，GPS2 mRNA水平上調，差異有統計學意義（均P＜0.05），見圖3。

2.6 HEK 293T應用miR-34a inhibitor后GPS2、p-JNK蛋白表達變化 Western blot顯示：對照組（Control）與陰性對照組（NC inhibitor）之間GPS2蛋白表達及p-JNK蛋白表達無明顯變化（P＞0.05）；與Control組和NC inhibitor組比較，Model組的GPS2蛋白表達減少，而p-JNK蛋白表達增加，差異有統計學意義（均P＜0.05）；與Model組比，沉默miR-34a基因后，GPS2蛋白表達增加，p-JNK蛋白表達減少，差異有統計學意義（均P＜0.05），見表3。

表2 大鼠缺血再灌注不同時間段GPS2、p-JNK蛋白相對表達量變化（每組n=5，±s）

圖3 HEK 293T應用miR-34a inhibitor后miR-34a、GPS2 mRNA水平變化

表3 HEK 293T應用miR-34a inhibitor后GPS2、p-JNK蛋白表達變化（每組n=3，±s）

3 討論

臨床上AKI的治療主要以消除致病因素、對癥治療為主，但被動等待腎小管細胞自行修復，其中部分患者可能會出現腎臟不完全修復、進展性纖維化等情況，從而造成不同程度的腎功能異常[6-7]，研究AKI進展至腎臟纖維化的可能機制并加以干預，對防治慢性腎臟病具有重要的意義。

MicroRNAs是一類長度約18～25個核苷酸的非編碼小RNA分子，它們主要通過誘導mRNA裂解調節轉錄后的靶基因表達或干擾靶蛋白翻譯水平起作 用[8]。本課題組在動物實驗中發現，miR-34a在缺血再灌注引起AKI后出現GPS2表達下調的現象。miR-34a是一種多功能調節因子，參與糖尿病腎病[9]或疾病纖維化病理的過程[10]，調節細胞增殖、凋亡和生長。GPS2在人體中許多組織都有表達，與許多蛋白相互作用，涉及細胞炎癥、細胞周期調節等多種生理病理活動[11-13]。文獻報道，miR-34a在AKI中過表達，可以靶向抑制SIRT1蛋白表達[14-15]，但miR-34a是否還可能調節其他靶向蛋白，目前國內外尚少研究。本課題組通過細胞實驗發現，miR-34a經缺氧再復氧的損傷后表達上調，GPS2的mRNA水平和蛋白表達均顯著下降；沉默miR-34a基因，GPS2的mRNA水平和蛋白表達均明顯增加。結合動物和細胞實驗，我們推測miR-34a在AKI中可能下調GPS2表達。

損傷涉及炎癥反應，干預不及時很快進入纖維化層面。在嚴重缺血、毒素和持續性炎癥反應下，腎小管上皮細胞出現變性、脫落、壞死、凋亡，IL-1β、IL-8等因子參與炎癥細胞的趨化與活化，使得炎癥反應加重[2]；損傷的腎小管上皮細胞激活蛋白激酶ATM[16]，啟動P53/P21通路，進而激活細胞內JNK信號通路，促進纖維化生長因子（TGF-β1和CTGF）的基因轉錄以及蛋白合成與分泌，作用于腎間質的成纖維細胞，促進其增殖和分化，導致腎間質纖維化[17]。本研究HE染色結果顯示，腎小管細胞在缺血再灌注后發生了不同程度的損傷，可見上皮細胞腫脹、空泡化、管腔擴張及刷狀緣消失等病理變化，表明大鼠腎臟缺血再灌注后出現明顯的腎小管形態學損傷，且隨著再灌注時間延長，其損傷加重。在缺血再灌注損傷后24 h和48 h，TNF-α、TGF-β表達水平明顯升高，說明存在從AKI向纖維化轉化的可能性。這一結果與文獻報道[18-19]相一致，并提示造模成功。JNK信號通路是MAPK信號通路途徑的分支，參與機體炎癥及纖維化。文獻報道GPS2能夠特異性抑制JNK信號通路，而對其余的MAPK途徑如P38通路則沒有抑制作用[20]。本研究發現，miR-34a在缺血再灌注引起的AKI后，GPS2蛋白表達下降，p-JNK蛋白表達增加；HEK 293T細胞經過缺氧/復氧模擬AKI后，GPS2的mRNA水平和蛋白表達下降，而p-JNK蛋白表達增加；沉默miR-34a基因后，GPS2的mRNA水平和蛋白表達明顯增加，p-JNK蛋白表達顯著下降，這一結果和CARDAMONE等[21]發現GPS2通過抑制JNK通路在抗炎反應中起著重要的作用相符合。

綜上所述，我們的動物和細胞實驗初步證明，miR-34a可能通過下調GPS2蛋白，間接激活JNK信號通路進而影響受損腎小管上皮細胞DNA修復，促進AKI發生和發展。