低免疫原性脫細胞神經基質的制備及其理化性能

王建英，李芳紅，李花瓊，王榮華，王辰飛，趙子建，

（1.溫州醫科大學 眼視光學院 生物醫學工程學院，浙江 溫州 325035；2.廣東工業大學 生物醫藥學院，廣東 廣州 510006）

外周神經損傷會導致感覺和運動功能的永久性損害和神經性疼痛，使患者的生活質量下降，給患者和社會帶來巨大的經濟負擔[1-2]。現有的神經移植物存在來源有限、疾病傳播、免疫排斥等問題。目前，因異種（豬）神經與人神經有著極其相似的解剖結構，為再生軸突提供指導和支持，是一種潛在的神經移植物[3]，異種脫細胞神經基質已成為用于修復較長神經缺損的移植物研究熱點。本研究以α-1，3-半乳糖苷轉移酶基因敲除（α-1，3-galactoside transferase gene knockout，GTKO）豬坐骨神經為實驗原料，采用自主設計的低滲溶液、胰蛋白酶、低濃度去垢劑及核酸酶組合的四聯脫細胞方案，制備低免疫原性異種脫細胞神經基質，檢驗脫細胞效果并嘗試建立一套完整的神經脫細胞方案，探索低免疫原性脫細胞神經基質用于修復長距離外周神經缺損的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：PBS、枸櫞酸鹽修復液、DAB顯色試劑盒（ZLI-9001）、兔SP試劑盒（SP-9001）、小鼠SP試劑盒（SP-9002）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；SDS、2.5%戊二醛購自上海阿拉丁公司；胰蛋白酶、醋酸異戊酯購自上海麥克林公司。DNA酶、RNA酶為美國Sigma公司產品。HE染色試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司。Triton-X100、DAPI染液、天狼猩紅染液購自北京索萊寶科技有限公司。膠原檢測試劑盒SircolTMsoluble collagen assay（S1000）購自英國Biocolor公司。抗I型膠原抗體（ab34710）、抗層黏連蛋白抗體（ab11575）、抗纖連蛋白抗體（ab6328）購自英國Abcam公司。抗agal抗體（I21412）、DNA提取試劑盒Residual DNA Sample Preparation Kit（4413686）、DNA檢測試劑盒Quant-iTTMPicoGreen dsDNA Reagent and Kits（P11496）購自美國Thermo公司。小鼠成纖維細胞系（L929）購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.2 主要儀器：Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司），DM 500型光學顯微鏡、DM 2500 LED型正置熒光顯微鏡（德國Leica公司），KD-BM型生物組織包埋機、KD2260型切片機（金華科迪儀器設備公司），LGJ-10型真空冷凍干燥機（北京華興科技發展有限公司），*/SU8220場發射掃描電子顯微鏡（日本Hitach公司），全波長微孔讀板機（美國BioTek精宏公司）。

1.2 方法

1.2.1 豬外周神經的獲得：南京華貞生物醫藥科技有限公司為本研究提供GTKO豬神經原料。經解剖后取得豬坐骨神經，入無菌PBS中立刻低溫運回實驗室。在實驗室去除神經組織中多余的脂肪及結締組織，并用無菌PBS清洗3次（連續攪拌），每次 15 min，去除殘余血液，保存在-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 脫細胞方法：在脫細胞處理前，先將神經組織徹底清洗，然后將神經組織放入超純水中， 4 ℃過夜。第2天將神經組織放入含0.25%胰蛋白酶（m/v）的PBS溶液中，37 ℃水浴作用1 h。將神經組織放入含0.1% SDS的PBS中，室溫下振蕩處理24 h，此步驟共循環2次。再將神經組織放入pH為 7.5 的50 mmol/L Tris-HCl溶液中，加入50 U/mL DNA酶和5 U/mL RNA酶，37 ℃水浴作用3 h。最后將神經組織在無菌PBS中清洗72 h，每24 h換液。將脫細胞神經基質放入-20 ℃冰箱中保存待檢。

1.2.3 HE染色：將樣品在4%多聚甲醛中固定24 h，經梯度乙醇脫水、二甲苯透明，浸蠟后包埋成組織塊，將神經樣品的橫截面切取4 μm厚的薄片，轉移至防脫片上，烤片，經二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水，然后進行組織學染色后顯微鏡下觀察。

1.2.4 DAPI染色：DAPI是一種能夠與DNA強力結合的熒光染料。在天然神經與脫細胞神經切片上滴加DAPI工作液，室溫避光孵育10 min，PBS漂洗3次，每次5 min。封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 殘留DNA定量檢測：分別稱取天然神經與脫細胞神經各10 mg（n=3），配制10 μL蛋白酶K加60 μL蛋白酶K緩沖液，每個樣品中加入70 μL消化液，于56 ℃水浴槽內消化，至待測樣品完全消化，無肉眼可見顆粒樣物為止。向2個反應體系各組加400 μL裂解液，渦旋10 s，靜置10 min，直至完全溶解。加入磁珠液30 μL（37 ℃水浴預熱），震蕩10 min。加入400 μL結合液，室溫下震蕩孵育10 min。離心5 s，置于磁力架，靜置 5 min。棄上清液，加300 μL洗滌液，渦旋10 s，快速離心15 s，置于磁力架，靜置1 min，再漂洗DNA至少2次，最后一次快速離心25 s，收集磁珠。在棄上清液后，室溫離心管敞口放置干燥，不得超過5 min。加100 μL溶出液，渦旋震蕩5 min，70 ℃水浴5 min（中途渦旋）。快速離心25 s，置于磁力架2 min，將原各組轉移上清液至新的一組離心管。加50 μL溶出液，渦旋震蕩5 min，70 ℃水浴5 min（中途渦旋），在新的一組離心管中共獲得150 μL的溶出液，再將其渦旋混勻后快速離心25 s， 獲得最終純化后的DNA。使用PicoGreen熒光定量測定脫細胞前后的神經組織DNA含量。采用Quant-iTTMPicoGreen dsDNA試劑盒，將樣品與熒光液等體積混合，室溫避光孵育5 min，在485 nm激發波長和 520 nm發射波長下測定熒光值，根據標準品的濃度和對應的熒光值繪制標準曲線，根據標準曲線得出樣品DNA殘留量。

1.2.6 天狼猩紅染色：在天然神經與脫細胞神經切片上滴weigert鐵蘇木素染色液，染色10～20 min， 酸性分化液分化數秒，自來水洗5～10 min，然后天狼猩紅染色液染色1 h，流水稍微沖洗，脫水、透明后，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。天狼猩紅染色使膠原纖維呈紅色、細胞核呈藍色、肌纖維成黃色。

1.2.7 免疫組織化學檢測：將天然神經與脫細胞神經切片用枸櫞酸鈉抗原修復液進行抗原修復，內源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min，PBS緩沖液清洗3次。滴加封閉用正常山羊血清工作液，室溫孵育1 h，將切片分別與抗I型膠原抗體、抗層黏連蛋白抗體、抗纖連蛋白抗體以1:200（v/v）的稀釋度4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，滴加生物素標記山羊抗兔/鼠IgG，室溫孵育1 h，PBS緩沖液沖洗3 次。再滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min，DAB顯色，蘇木素復染核。

1.2.8 膠原定量檢測：稱取天然神經與脫細胞神經各10 mg（n=3），在胃蛋白酶濃度為0.1 mg/mL的0.5 mol/L乙酸溶液中4 ℃過夜孵育，酶活性在 4 ℃下有效去除末端非螺旋端肽以將膠原釋放到溶液中。膠原蛋白標準品使用含有0、5、10和15 μg膠原蛋白參考標準品的等分試樣100 μL。向標準曲線樣品和測試樣品（100 μL）中加入1 mL Sircol Dye Reagent，機械振蕩混勻30 min，在此期間，膠原-染料復合物將從可溶性未結合的染料中形成并沉淀出來，以12 000 r/min離心10 min。倒掉上清液，留底部沉淀。將750 μL鹽酸鹽洗滌試劑加在膠原染料顆粒上，從顆粒表面和微量離心管內表面除去未結合的染料，以12 000 r/min離心10 min。將洗滌液排入廢物容器中，將250 μL堿性試劑添加到樣品中，渦旋，當所有結合的染料已經溶解時，將200 μL樣品轉移到96孔板的各個孔中，酶標儀參數設置為555 nm，或最接近匹配藍綠色濾色片。測試空白試劑、標準品和測試樣品的吸光度，從標準曲線獲得膠原蛋白濃度。

1.2.9 異種抗原檢測：將天然神經與脫細胞神經切片經枸櫞酸鈉溶液抗原修復，正常山羊血清封閉后，滴加抗a-gal抗體（1:1 000）4 ℃孵育過夜，因所購買的抗a-gal抗體自帶熒光，孵育抗a-gal抗體后直接封片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.10 掃描電鏡：將天然神經與脫細胞神經樣品經2.5%戊二醛固定24 h，梯度乙醇脫水，醋酸異戊酯置換乙醇，然后將樣品冷凍干燥24 h，噴金鍍膜后掃描電鏡觀察。

1.2.11 細胞毒性檢測：將L929細胞置于MEM培養液中37 ℃、5% CO2濕度飽和培養。培養液每隔3 d更換1次，待細胞融合度達到80%～90%時，進行1次傳代，并選第3代對數生長期的細胞進行實驗研究。參考GB/T 16886.5-2003體外細胞毒性試驗與GB/T 16886.12-2000樣品制備和參照材料，按0.1 g/mL的比例將脫細胞神經基質浸泡于MEM培養基中，37 ℃ 培養24 h，制備浸提液，以完全培養基作為對照。將L929細胞按1 000個/孔的密度接種于96孔細胞培養板內，每孔加入MEM培養基100 μL，置于CO2培養箱中，待細胞貼壁后，實驗組完全培養基更換為浸提液，分別在培養第1、第2、第3天每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養箱內孵育2 h后測OD450。在CCK-8方法中，OD值越大，細胞活性越好，表明材料毒性越小。

1.3 統計學處理方法 采用Graphpad Prism7.0軟件進行統計學分析。計量資料以±s 表示，2組比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 脫細胞效果 HE結果顯示脫細胞神經組織結構保留完整，有著與天然神經類似的神經束與結締組織。在天然神經中，可看到在神經內膜及神經束膜中均有大量細胞，包括施萬細胞及組織間隙細胞。脫細胞神經HE染色結果顯示細胞已從組織中去除（見圖1）。DAPI染色結果顯示，天然神經組織有較強的藍色熒光，即細胞核成分，而脫細胞神經組織并無細胞核成分（見圖2）。HE與DAPI結果均表明脫細胞過程將神經組織中的細胞成分完全去除。DNA殘留檢測結果顯示天然神經和脫細胞神經的DNA含量平均值分別為（831.62±29.37）ng/mg與（35.72±2.14）ng/mg。可見與天然神經相比，脫細胞神經有極低的DNA含量，進一步表明脫細胞神經基質細胞去除完全。

2.2 膠原纖維保留情況 天狼猩紅染色結果顯示天然神經膠原纖維排列規則且致密，脫細胞神經膠原纖維致密性變疏松，但未見膠原纖維的顯著損失（見圖3）。

圖1 天然神經（A、B）和脫細胞神經（C、D）HE染色

圖2 天然神經（A）和脫細胞神經（B）DAPI染色（藍色熒光代表細胞核）

圖3 天然神經（A）和脫細胞神經（B）天狼猩紅染色（紅色代表膠原纖維）

2.3 膠原蛋白定量檢測結果 脫細胞神經樣品的每毫克組織濕重的膠原蛋白量較天然神經減少 （[709.89±32.13）μg/mg vs（. 828.70±15.13）μg/mg]， 差異有統計學意義（P＜0.05），表明脫細胞化過程對膠原蛋白含量的輕微損害。

2.4 細胞外基質蛋白保留情況 免疫組織化學染色顯示與天然神經相比，細胞外基質的主要蛋白組分I型膠原、層黏連蛋白、纖連蛋白在脫細胞神經內膜、中膜、外膜中保留（見圖4）。

2.5 異種抗原殘留情況 免疫熒光結果顯示，與天然神經相比，脫細胞神經中a-gal抗原幾乎無表達（見圖5），由此可見脫細胞神經基質具有免疫原性低的特點。

2.6 脫細胞神經基質超微結構 掃描電鏡顯示脫細胞神經有著與天然神經類似的膠原纖維網格，三維組織結構保存完整，但與天然神經相比，脫細胞神經有著較大的孔隙率，移植后有利于宿主細胞的遷移。見圖6。

2.7 脫細胞神經基質細胞毒性檢測結果 用脫細胞神經基質制備的浸提液培養細胞3 d后，細胞生長狀況良好，其OD450值與天然神經比，差異均無統計學意義（P＞0.05）。細胞毒性檢測結果證明所制備的脫細胞神經基質對細胞無明顯毒性。

3 討論

外周神經系統（peripheral nervous system，PNS）損傷是一個日益嚴重的醫學和公共衛生問題，常伴隨其他身體創傷，在所有入住I級創傷中心的患者中，5%的患者伴隨PNS損傷，每年僅在美國就有超20萬次的神經修復手術[4]。在中國，周圍神經損傷病例每年新增60～90萬例，其中需要通過神經移植來修復神經的病例為30～50萬例[5]。

圖4 天然神經（A、C、E）和脫細胞神經（B、D、F）I型膠原（A、B）、層黏連蛋白（C、D）、纖連蛋白（E、F）免疫組織化學染色結果

圖5 天然神經（A）和脫細胞神經（B）a-gal免疫熒光（紅色熒光代表a-gal異種抗原）

較短的外周神經損傷，可以采用神經斷端直接縫合方式來修復，但較長神經缺損直接斷端縫合會引入縫合張力，縫合張力會抑制神經再生。神經間隙超過1 cm時，神經移植便是外周神經修復的一個重要策略[6]，自體神經移植是神經移植術的金標準。自體神經生物相容性較好，提供了刺激性支架，包括可存活的施萬細胞和神經營養因子，在支持再生軸突方面發揮重要作用[7]。但可供神經移植的自體神經來源極其有限，且會對患者造成二次損傷，供體部位發病率增加，疼痛，瘢痕形成，神經瘤形成和供體區域的感覺喪失[8-10]。由生物型材料（肌肉、靜脈等）和非生物型材料（聚乳酸、膠原、殼聚糖、硅膠管）構建的神經導管，部分材料已被批準進入臨床階段，對部分PNS有較好的修復效果[11]。但因其缺乏類似天然神經的細胞外基質結構，無法成為支持神經元和施萬細胞再生的基質。當間隙長度超過3 cm時，神經功能恢復率降低[7]。隨著組織工程和再生醫學的發展，細胞外基質衍生的生物材料已在臨床上用于不同組織和器官的修復，如小腸黏膜下層、心包、肌腱、韌帶、血管等[12]。脫細胞神經基質是將天然外周神經脫細胞處理后，清除了施萬細胞、神經外膜和神經束膜的細胞，以及神經纖維的髓鞘，形成的以施萬細胞基底膜為主，以神經束膜和外膜的基質為外套的完整三維立體支架[13]。 異種脫細胞神經基質不僅作為支持材料，還作為細胞的調節劑，影響細胞存活、增殖、形態發生和分化[14]，同時也保留了類似于天然神經的三維組織 結構，表面形貌對神經系統的發育具有深遠的影響， 例如神經元分化和形態發生及促進軸突再生[4]。

動物源性材料作為異種材料植入人體后，其細胞表面的a-gal抗原與人體內存在的天然抗a-gal抗體結合，會激活補體系統引起嚴重的超級性排斥反應，最終導致異種移植失敗[15]。因此去除供體豬器官中的α-1，3-半乳糖分子是獲得成功異種移植的關鍵步驟。美國麻省總醫院進行了GTKO豬的腎臟或心臟移植到狒狒的臨床前實驗，成功地克服了超急性免疫排斥反應，移植心臟和腎臟的存活時間顯著延長，為異種移植邁出了堅實的第一步[16]。本研究以GTKO豬坐骨神經為實驗原料，從根源上降低免疫原性，脫細胞處理后，進一步去除異種抗原，制備低免疫原性脫細胞神經基質。

圖6 天然神經（A、B）和脫細胞神經（C、D）掃描電鏡結果

目前脫細胞神經基質的制備，大都采用單一高濃度去污劑（例如脫氧膽酸鈉、Triton等）或高濃度酸堿試劑（例如氫氧化鈣、硫化鈉和氫氧化鈉）來達到去細胞目的[17-21]，采用物理化學酶法聯合脫細胞方案制備脫細胞神經基質的報道較少，本研究以GTKO豬坐骨神經為實驗材料，采用自主設計的低滲溶液、胰蛋白酶、低濃度去垢劑及核酸酶組合的四聯脫細胞方案。脫細胞的目的就是在不破壞組織細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的同時將引發免疫反應的細胞成分從組織中去除，但在脫細胞過程中對于ECM的破壞是不可避免的[22]。因此在脫細胞過程中，我們應盡可能減少對ECM的破壞。目前主要的脫細胞方法主要分為物理方法、化學方法及酶消化法。常用的物理方法包括反復凍融、機械力學處理，一般而言，物理方法脫細胞效果較差，但對ECM的破壞較小。常用于脫細胞的化學試劑包括酸堿試劑、低滲和高滲溶液、洗滌劑等。常用于脫細胞的酶類包括胰蛋白酶、中性蛋白酶、膠原酶、核酸酶等[23]。有研究表明堿（例如氫氧化鈣、硫化鈉和氫氧化鈉）去細胞效果足夠強，然而堿可以完全消除基質中的生長因子，并且比化學和酶促劑更顯著地降低ECM機械性能[24]。有研究在制備脫細胞小口徑血管支架時，發現Triton具有強烈的毒性并且不容易通過洗滌去除，脫細胞處理后，組織中殘留的洗滌劑會滲透到組織中，即使是較低劑量也會導致細胞毒性[25-27]。胰酶能夠提高后續去細胞劑的滲透性，因此在去細胞過程尤其是對于致密的組織中首先使用胰酶成為脫細胞過程中的必要步驟[28]。故本研究的四聯脫細胞方案先采用簡單的滲透作用導致細胞溶解，破壞細胞膜結構，再用胰蛋白酶溶液消化處理（先用胰蛋白酶溶液處理，有利于后續脫細胞溶液的進入），隨后使用低濃度離子型洗滌劑（SDS）溶解細胞膜，最后用核酸酶裂解核酸序列并清除細胞裂解后的核酸物質，以達到較好的脫細胞效果。脫細胞處理后，用無菌PBS溶液徹底清洗，去除殘留在組織中的脫細胞試劑。

廣泛使用異種組織用于生物支架的最大障礙是在所得支架基質中存在殘留DNA[29]。有效的去細胞方法應滿足以下標準：①HE和DAPI染色看不見殘留的細胞核；②干燥組織中DNA含量不超過50 ng/mg； ③DNA片段的大小不超過200 bp[30]。本研究中，HE、DAPI染色結果及DNA定量結果均表明該脫細胞方案脫細胞效果良好，HE及DAPI圖像均看不到細胞核，DNA檢測顯示脫細胞神經DNA含量極低。天狼猩紅染色及1型膠原免疫組織化學結果顯示脫細胞神經膠原成分保留較好，膠原蛋白是細胞外基質組分的主要成分，主要維持神經的力學性能[31]。免疫組織化學結果顯示脫細胞神經層黏連蛋白和纖連蛋白保留較好，層黏連蛋白也是ECM的主要蛋白質，參與細胞分化、遷移和黏附活動。層黏連蛋白是一種黏合劑成分，可在神經損傷后為基底層支架提供再生促進能力，并且已被證明可促進體外神經發生[32]。纖連蛋白具有用于黏附許多細胞類型的配體，促進宿主生物相容性，有利于神經再生[31]。掃描電鏡顯示脫細胞神經有著與天然神經類似的三維組織結構，研究表明表面形貌對神經系統的發育具有深遠的影響，例如神經元分化和形態發生及促進軸突再生。掃描電鏡結果顯示脫細胞神經與天然神經相 比，有較大的孔隙率，有研究表明，較大的孔隙率促進細胞浸潤和遷移[33]。以GTKO豬坐骨神經為實驗原料，并且經脫細胞處理后，引起急性免疫排斥反應的異種抗原a-gal基本去除干凈，免疫熒光結果顯示與天然神經相比，脫細胞神經無a-gal抗原表位的表達，證明其有較低的免疫原性。去污劑有一定的細胞毒性，通過觀察脫細胞神經基質浸提液對小鼠成纖維細胞生長狀況的影響來評價去污劑的殘留情況，CCK-8細胞增殖毒性檢測結果顯示神經組織脫細胞處理后，經PBS多次清洗，基本可以將去污劑去除干凈，用脫細胞神經基質浸提液培養細胞，細胞生長狀況良好，結果與對照組差異無統計學意義。證明脫細胞神經基質低細胞毒性。

綜上，利用GTKO豬坐骨神經所制備的脫細胞神經基質無細胞組分殘留，細胞外基質組分保留較好，并且具有低免疫原性、低細胞毒性的特點。本研究在體外實驗基礎上探究了低免疫原性異種脫細胞神經基質修復長距離外周神經缺損的可行性，接下來的工作重點為動物體內實驗驗證低免疫原性異種脫細胞神經基質修復外周神經功能的效果。