缺氧誘導基因2誘導甘油三酯堆積穩態失衡促進肝癌發生的研究

劉詠真，康靜波，杜 銳，鄭 偉

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，全世界范圍內統計其發病率占全身腫瘤的第5位，死亡率占全身腫瘤的第3位[1]。臨床上治療方法主要為手術切除，然而治療效果不甚理想[2]。絕大多數HCC患者的死亡源于肝癌的轉移，因此對參與HCC細胞轉移的調控因子功能進行相關研究，具有重要的意義。癌癥的發生和進展受行為和環境導致的脂質穩態失衡影響[3]。腫瘤脂肪代謝給快速增長的腫瘤細胞提供增殖所需要的能量，并且脂質的再生已經成為HCC的重要標志。過度營養和肥胖是肝臟腫瘤發生的危險因素，主要是通過促進有利于癌癥生長的炎癥環境。

缺氧誘導基因2(hypoxia-inducible gene 2,HIG2)，也稱為缺氧誘導型脂滴相關蛋白，在多種缺氧性腫瘤組織出現[4]。HIG2增強Wnt通路和脂質代謝激活[5]，促進了膠質瘤的發生[6]。另外，HIG2通過抑制細胞凋亡可以促進腫瘤細胞生長[4]。但是，HIG2在HCC中的意義尚不清楚。本研究旨在探討HIG2在HCC發生發展中的作用和意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 QZG、HepG2和SMMC7721細胞購于中國科學院上海細胞庫；收集2016年3月—2018年12月中國人民解放軍總醫院第六醫學中心手術切除的30例HCC患者的腫瘤組織樣本及對應癌旁組織，其中男性19例，女性11例，年齡36～64歲，平均年齡48.5歲?；颊呔阎?，并通過倫理審查。羊抗兔HIG2抗體(英國Abcam公司，ab78349)、β-actin(北京博奧森生物技術有限公司)；羊抗兔IgG-HRP(美國Santa Cruz 公司)；1640培養基(美國HyClone公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；Lipofectamine 3000轉染試劑(美國Invitrogen公司)；免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；HIG過表達質粒(上海吉凱基因化學技術有限公司)；Trizol試劑(生工生物工程股份有限公司)；實時定量熒光PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)檢測試劑盒(日本Takara公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 細胞采用含10%胎牛血清的1640培養基進行培養，消化傳代如常。以1×105接種于25 cm2培養皿，生長至70%～80%時，Lipofectamine 3000轉染試劑進行質粒轉染，48 h收集細胞。

1.2.2 qRT-PCR 使用Trizol試劑提取總RNA，用TaKaRa逆轉錄試劑盒逆轉錄。將等分的cDNA用作PCR的模板，引物由Primer 5.0軟件設計。HIG2基因上游引物序列為5′-GCACGACCTGGTGTGACTGT-3′，下游引物序列5′-CCAGCACATAGAGGTTCAGCAT-3′；內參β-actin上游引物序列為5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物序為5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。使用實時LightCycler快速熱循環儀檢測，PCR反應條件為：95 ℃預變性15 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火31 s，72 ℃延伸40 s。共進行40個循環。

1.2.3 Western Blot法檢測 HIG2蛋白表達：含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞，隨后4 ℃下12 000 r/min離心20 min，取上清。留取30 μL采用BCA法檢測蛋白含量，其余加入5×上樣緩沖液，于100 ℃加熱變性。加各組蛋白上樣液進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，將膜與第一抗體在4 ℃溫育過夜：抗HIG2(1∶1 000)，β-actin(1∶1 500)；次日二抗孵育1 h，然后使用增強的化學發光系統掃描條帶，并通過Image J軟件定量。

1.2.4 劃痕實驗和侵襲實驗 滅菌的marker在6孔板背后，用滅菌的直尺比著，均勻地劃橫線，每隔0.5～1 cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線，孔中鋪約5×105個細胞，次日用槍頭比著直尺，垂直于背后的橫線劃痕。用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基，放入37 ℃ 5% CO2培養箱中培養。當細胞增殖到孔板表面的100%左右時，在每個孔中劃出1 mm寬的劃痕，在劃痕實驗0和24 h顯微鏡(型號：EVOS M7000，美國Thermo Fisher公司)觀察記錄拍照。用Image J軟件計算劃痕的距離，比較0和24 h的劃痕的空白寬度，表示細胞相對移位率。

使用涂有Matrigel的聚碳酸酯膜過濾器(8 μm孔徑)(美國Sigma公司)的Transwell小室在體外測量細胞侵襲量。通過顯微鏡下在200個放大倍數下每個孔中的10個隨機視野上計數穿透細胞來確定侵襲能力，實驗重復3次。

1.2.5 甘油三酯含量檢測 加入pH7～7.4P PBS或生理鹽水0.2～0.3 mL冰水浴條件下進行超聲破碎勻漿，加入對氯酚，生成的醌類化合物于510 nm波長的吸光值與甘油三酯的含量成正比，于510 nm波長分別測定標準管和樣本管的吸光度值，計算甘油三酯含量。

1.2.6 細胞增殖檢測 HepG2細胞接種到96孔板中，通過細胞計數，每孔接種50 000個細胞，分別培養24、48、72和96 h后，將10 μL CCK8反應混合物(美國APExBIO公司)添加到每個孔中，孵育2 h后，酶標儀(型號：Multiskan GO，美國Thermo Fisher公司)調整波長至450 nm，檢測每孔的吸光度。每個時間點的吸光度可以代表該時間的細胞存活率，然后比較每個樣品的吸光度趨勢即可作為測定結果。

2 結果

2.1 HIG2在人肝癌組織、癌旁組織和肝癌細胞系中表達情況 采用qRT-PCR檢測30例肝癌組織和對應肝癌癌旁組織中HIG2基因的表達，結果顯示，與肝癌癌旁組織比較，肝癌組織中HIG2基因的豐度增加，差異比較具有統計學意義(P<0.05)(圖1A)。通過Western Blot方法分別檢測肝癌癌旁組織、肝癌組織和正常肝細胞(QZG)、肝癌細胞系(HepG2、SMMC7721)HIG2蛋白的表達水平。結果顯示，與肝癌癌旁組織比較，肝癌組織中HIG2蛋白表達水平增加，差異比較具有統計學意義(P<0.05)(圖1B)；與正常肝細胞系比較，肝癌細胞系中HIG2蛋白表達水平增加，差異比較具有統計學意義(P<0.05)(圖1C)。免疫組織化學方法檢測肝癌癌旁組織和肝癌組織中HIG2蛋白水平，結果顯示HIG2蛋白在肝癌組織中高表達，并且主要在胞漿中(圖1D)。

2.2 正常肝細胞系和肝癌細胞系的甘油三酯含量檢測 通過甘油三酯檢測試劑盒檢測每6×106個正常肝細胞系QZG和2個肝癌細胞系HepG2和SMMC7721甘油三酯含量，結果顯示，HepG2和MMC7721甘油三酯含量[(16.94±0.33)mg/dL，(16.04±1.02)mg/dL]均高于正常肝細胞系QZG[(4.90±0.39)mg/dL](P<0.05)(圖2)。

注：A.qRT-PCR分析30例肝癌組織和30例肝癌癌旁組織中HIG2基因的豐度；B.Western Blot方法檢測2例肝癌癌旁組織和2例肝癌組織中HIG2蛋白的表達水平；C.Western Blot方法檢測正常肝細胞系QZG和肝癌細胞系HepG2和SMMC7721的HIG2蛋白表達水平，與QZG比較，*P<0.05；D.免疫組織化學方法檢測肝癌癌旁組織(normal liver tissue)和肝癌組織(T：tumor tissue癌組織；N：paired peritumoraltissue癌旁)中HIG2的蛋白水平(圖中標尺代表50 μm)圖1 HIG2在人肝癌組織、癌旁組織和肝癌細胞系中表達情況

注：甘油三酯檢測試劑盒檢測每6×106個正常肝細胞系QZG和肝癌細胞系HepG2和SMMC7721的甘油三酯含量，與QZG比較，*P<0.05圖2 甘油三酯檢測試劑盒檢測正常肝細胞系和肝癌細胞系甘油三酯含量

2.3 HIG2的過表達質粒影響肝癌細胞的侵襲和轉移情況 使用涂有Matrigel的聚碳酸酯膜的Transwell小室測定細胞侵襲和遷移能力，結果顯示HIG2的過表達質粒顯著增加了HepG2細胞的遷移率(P<0.05)(圖3A)。通過劃痕實驗比較轉染了對照質粒以及轉染了HIG2過表達質粒的HepG2細胞的細胞遷移率，在劃痕實驗0和24 h顯微鏡觀察記錄圖片，用Image J軟件分析0和24 h細胞進入劃痕區域的相對距離。與對照組比較，HIG2過表達組細胞的劃痕縫隙顯著變小，愈合程度顯著增加(P<0.05)(圖3B)。

注：A.Transwell實驗分析轉染對照質粒(pcDNA-control)和HIG2基因的過表達質粒(pcDNA-HIG2)的HepG2細胞的遷移能力；B.劃痕實驗分析轉染了pcDNA-control以及轉染了pcDNA-HIG2的HepG2細胞，測量0和24 h細胞進入劃痕區域相對位移率，來評估細胞遷移，右側柱狀圖顯示0和24 h劃痕空隙的寬度變化，與pcDNA-control組比較，*P<0.05圖3 Transwell實驗和劃痕實驗分析HIG2的過表達質粒影響肝癌細胞的侵襲和轉移情況

2.4 HIG2影響肝癌細胞的增殖情況 通過甘油三酯檢測試劑盒檢測轉染了對照質粒以及轉染了HIG2過表達質粒的HepG2細胞，結果顯示HIG2基因的過表達質粒轉染組的HepG2細胞的甘油三酯含量[(106.20±7.56)mg/dL]比轉染了對照質粒的HepG2細胞的甘油三脂含量[(23.40±2.66)mg/dL顯著增加(圖4A)，細胞增殖率顯著增加(圖4B)。HepG2細胞轉染了HIG2基因的小干擾(siRNA)質粒甘油三酯含量[(10.59±0.61)mg/dL]比轉染對照質粒的HepG2細胞的甘油三酯含量[(26.17±2.37)mg/dL]顯著降低(P<0.05)(圖4C)，細胞增殖率下降(圖4D)。

注：A.甘油三酯檢測試劑盒檢測每6×106個轉染對照質粒(pcDNA-control)和HIG2基因的過表達質粒(pcDNA-HIG2)的HepG2細胞的甘油三酯含量，與pcDNA-control組比較，*P<0.05；B.CCK8檢測轉染對照質粒和HIG2基因的過表達質粒的HepG2細胞24、48、72和96 h的增殖率，與pcDNA-control組比較，*P<0.05；C.甘油三酯檢測試劑盒檢測每6×106個轉染對照質粒(pSilencer3.1)和HIG2基因的siRNA質粒(pSilencer-HIG2)的HepG2細胞的甘油三酯含量，與pSilencer3.1組比較，*P<0.05；D.CCK8檢測轉染對照質粒和HIG2基因的siRNA質粒的HepG2細胞24、48、72和96 h的增殖率，與pSilencer3.1組比較，*P<0.05圖4 甘油三酯檢測試劑盒檢測HIG2影響肝癌細胞的增殖情況

3 討論

HCC是世界上最常見的腫瘤之一，已成為中國癌癥相關死亡的第二大原因[7]。雖然在診斷和手術治療方面取得了很大進展，但HCC的復發率和轉移率仍然很高。此外，HCC患者在初步診斷時通常處于晚期階段，HCC晚期疾病患者的預后仍不理想[8]。盡管在調控HCC的分子機制研究方面取得了重大進展，但闡明肝癌發生的精確調控仍需要付出巨大努力。尋找特異性的HCC標志物用于臨床診斷，具有重要的意義。

包括HCC在內的多種腫瘤均處在缺氧微環境中[9]。腫瘤細胞中細胞存活、細胞增殖、血管生成和脂代謝關鍵的基因在缺氧微環境中異常表達[10]。實體瘤中的癌細胞是處于低氧環境的，低氧會激活低氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIFs)，激活的HIFs促使細胞的代謝方式發生改變以適應低氧環境[11]。近期研究發現，低氧環境下癌細胞中的脂肪酸代謝異常對腫瘤的生長和轉移也發揮著重要的作用。脂肪酸作為能量貯存主要有2種形式：一是以甘油三酯的形式存在，甘油三酯被合成貯存在脂滴中，當細胞需要其生成能量時，會利用一系列酶解反應將其分解；二是以膽固醇形式儲存在脂滴中，膽固醇協助細胞信號傳導通路的正常運行[12]。貯存甘油三酯的脂滴，有抵抗活性氧毒性的作用。研究發現，抑制腫瘤細胞內甘油三酯的儲存，降低對活性氧毒性的抵抗作用，促進了腫瘤細胞的損傷，抑制腫瘤細胞的生長[13]。HCC是所有癌癥中受肥胖影響最大的腫瘤。肝臟脂代謝的調控機制十分復雜，與多條信號通路及關鍵靶點有著密切的關系。HIG2是一種特異性的缺氧誘導基因，首次被Denko等發現，其cDNA全長1 372個核苷酸[14]。HIG2作為缺氧誘導基因，在腫瘤缺氧微環境下異常表達，并且作為一種新型脂滴蛋白質可以誘導細胞內甘油三酯積累，具有重要的臨床意義[15]。哺乳動物的細胞在營養過剩時，將甘油三酯儲存在細胞的脂滴中，當細胞處在饑餓或生理活動下，細胞內脂解的過程將甘油三酯水解為游離脂肪酸和甘油，用于進一步進入線粒體進行β氧化產生能量以及脂質和生物膜的合成。細胞內甘油三酯的分解和聚集精密調控著細胞能量穩態的維持。甘油三酯聚集和水解過程的失調導致各種病理變化，包括代謝綜合征，動脈粥樣硬化，脂肪肝，肝癌。因此，我們推測肝癌細胞中甘油三酯的水解失調是促進HCC進展的關鍵。研究表明HIG2在結直腸癌，膠質瘤，腎細胞癌和子宮癌中均有發現[16]，并且HIG2-9-4肽疫苗在腎細胞癌的治療中取得了一定療效[17]。本研究發現HIG2的表達在HCC組織中有明顯增加，免疫組織化學檢測顯示HIG2蛋白主要在肝細胞胞漿中高表達。并且通過過表達HIG2，可以顯著誘導肝癌細胞的甘油三酯的堆積，同時促進了肝癌細胞的侵襲和轉移潛力。

綜上所述，HIG2通過甘油三酯的堆積在HCC的發生發展過程中發揮重要的作用，然而其具體分子機制還尚不清楚，這也是我們接下來要研究的重點。隨著HIG2基因基礎及臨床研究的逐步深入，HIG2基因必將成為一種有效的腫瘤治療手段并為篩選HCC臨床診斷的腫瘤標志物以及分子藥物治療的靶標提供了理論依據。