具有抗蛋白附著和再礦化功能的復合樹脂的初步研究

梅 美，楊 巍，馬永剛，張 寧

由于復合樹脂材料美學和力學性能的改進，近年來廣泛應用于修復牙體缺損。填料成分和樹脂基質的進步改善了復合樹脂的性能[1]。研究表明，復合樹脂材料表面較其他修復材料更容易堆積菌斑[2]。菌斑產酸引起繼發(fā)齲，是充填材料脫落的主要原因[3]。唾液蛋白吸附于復合樹脂表面形成獲得性膜，是形成菌斑的先決條件[4]。如果復合樹脂具有抗蛋白附著功能，則可以有效地限制菌斑的形成和繼發(fā)齲的發(fā)生。甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine，MPC)是一類常見的具有抗蛋白附著和細菌粘附功能的生物復合物，已經被廣泛應用于臨床[5-6]。磷酸鈣復合樹脂是另一類改性復合樹脂材料的代表，其可以釋放超飽和態(tài)的鈣、磷離子使牙體硬組織的病損區(qū)域發(fā)生再礦化。通過霧化干燥技術合成的無定形磷酸鈣納米顆粒(nanoparticles of amorphous calcium phosphate,NACP)的粒徑大小僅有100 nm左右。NACP釋放的鈣、磷離子與傳統(tǒng)的磷酸鈣復合體相似，但是具有更優(yōu)的機械強度及性能[7]。本研究將MPC和NACP添加到復合樹脂中，從而研發(fā)出一種具有抗蛋白和再礦化功能的復合樹脂，并研究其對力學性能和菌斑生物膜的影響。

1 材料和方法

1.1 含有MPC和NACP的復合樹脂的制備 使用霧化干燥技術合成NACP。將碳酸鈣(美國Fisher公司)和無水磷酸氫鈣(美國Baker Chemical公司)溶解到乙酸中，以獲得終濃度分別為8 mmol/L和5.333 mmol/L的鈣離子和磷離子。Ca/P摩爾比為1.5，與無定型磷酸鈣(amorphous calcium phosphate,ACP)中一樣。將此溶液噴入到加熱的噴霧干燥裝置中，通過靜電沉淀器收集干燥的ACP納米顆粒(美國Air Quality公司)，獲得平均粒徑為116 nm的粉末狀NACP。雙酚A-甲基丙烯酸縮水甘油酯和雙甲基丙烯酸二縮三乙二醇酯(美國Esstech公司)按照質量分數比為1∶1混合，并混入0.5%的光引發(fā)劑樟腦醌(camphorquinone,CQ)，從而構成樹脂基質[8]。根據以往研究，MPC(美國Sigma-Aldrich公司)粉末以質量分數為10%的比例混入樹脂基質中[9]。樹脂基質與NACP，以及經過硅烷化處理的無機填料(美國Caulk/Dentsply公司)按照質量分數比為3∶2∶5混合[7-8]。添加MPC和NACP的復合樹脂作為實驗組，商品化的復合樹脂Heliomolar(加拿大Ivoclar公司)作為對照組，根據商品說明，其樹脂基質成分與實驗組相同。

1.2 力學性能的測試 應用模具將復合樹脂制成尺寸為2 mm×2 mm×25 mm的長方形試件。每個試件每個表面光固化1 min。試件在37 ℃蒸餾水中浸泡1 d后，使用萬能材料測試機(美國MTS公司)進行三點彎曲試驗[9-10]。跨度為10 mm，以1 mm/min的速度加力直到試件斷裂。彎曲強度按照公式3PmaxL/(2bh2)計算，其中P為斷裂時的載荷，L為跨距，b為試件的寬度，h為試件的厚度。彈性模量按照公式(P/d)[L3/(4bh3)]計算，其中d為線性彈性區(qū)域的斜率。每組6個試件。

1.3 抗蛋白附著性能的測試 對于抗蛋白和抗菌性能的測試，每個試件制成直徑10 mm、厚2 mm的圓柱型試件，制作時兩面用賽璐珞條形成光滑表面。每個試件每個表面光固化1 min，然后將試件浸入蒸餾水，攪拌1 h，以除去任何未固化的單體[9]。所有試件干燥并用環(huán)氧乙烷消毒(型號Anprolene AN 74i，美國Andersen Products公司)。

雙辛丁酸法測試試件表面蛋白的附著量[5-6,9]。每個試件在磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中浸泡2 h，然后再將試件浸泡在濃度為4.5 g/L的牛血清蛋白溶液中(美國Sigma-Aldrich公司)，在37 ℃條件下浸泡2 h。將試件在PBS中漂洗5 min，然后將試件放入含有1%十二烷基硫酸鈉的PBS溶液中，超聲振蕩20 min[5-6,9]。應用蛋白質分析試劑盒(美國Fisher Scientific公司)測試PBS溶液中的蛋白質濃度，從而計算附著在試件表面的蛋白質的量。每組6個試件。

1.4 人唾液的收集和菌斑生物膜的形成 經患者知情同意，簽署知情同意書。選擇10名擁有天然牙列，無活動性齲病或牙周病的健康成年人作為唾液的捐贈者。捐贈人在過去的3個月內沒有使用過抗生素，捐贈唾液前24 h不刷牙，并在捐贈唾液前至少2 h禁飲食。捐贈者在咀嚼封口膜的過程中收集分泌的刺激性唾液，并置于冰上。從每位捐贈者的唾液樣本中取出等量的唾液混合，混合的唾液在無菌甘油中稀釋至終濃度為70%，儲存于-80 ℃[11]，用于體外培養(yǎng)人全菌菌斑生物膜。

混合唾液以1∶50的比例稀釋于McBain培養(yǎng)基中作為人全菌生物膜的接種液。McBain培養(yǎng)基中含有粘蛋白，2.5 g/L；細菌蛋白胨，2.0 g/L；胰蛋白胨，2.0 g/L；酵母提取物，1.0 g/L；氯化鈉，0.35 g/L；氯化鉀，0.2 g/L；氯化鈣，0.2 g/L；鹽酸半胱氨酸，0.1 g/L；血紅素，0.001 g/L；維生素K1，0.000 2 g/L，材料均購自美國Sigma-Aldrich公司，pH值調整為7[12]。24孔培養(yǎng)板每個孔放入1個試件，各孔中加入1.5 mL接種液，在37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h。然后將試件轉移至新的24孔板中，用新鮮McBain培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16 h。將試件轉移至新的24孔板中用新鮮McBain培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，最終得到培養(yǎng)2 d的生物膜[9]。

1.5 生物膜活/死細菌染色 將培養(yǎng)2 d的試件在PBS中輕柔漂洗3次，用活/死細菌生存力試劑盒(美國Molecular Probes公司)進行染色[8-9]。Syto 9將活細菌染色，產生綠色熒光；細胞膜受損的細菌會被碘化丙啶染色，產生紅色熒光；接近或重疊的死/活細菌會顯示出橙黃色。使用熒光顯微鏡(型號TE2000-S，日本Nikon公司)觀察染色的生物膜。每組6個試件，每個試件隨機選取3副圖，每組試件一共18副圖。

1.6 菌落形成單位(colony forming unit，CFU)計數 將培養(yǎng)2 d的菌斑生物膜圓形試件轉移到2 mL試管中，通過超聲震動收獲生物膜，再用渦旋混合震蕩儀(美國Fisher公司)混勻。使用3種瓊脂平板培養(yǎng)測定CFU：①用胰蛋白大豆血瓊脂培養(yǎng)板進行全菌測定[12]；②用含有15%的蔗糖的輕型唾液鏈球菌瓊脂(mitis salivarius agar,MSA)培養(yǎng)板來進行總鏈球菌測定[13]；③致齲性的變形鏈球菌對桿菌肽有抗藥性，桿菌肽常被用來從口腔菌群中分離變形鏈球菌[12]，用加0.2 U/mL的桿菌肽的MSA瓊脂培養(yǎng)板中來測定變形鏈球菌。

2 結果

2.1 力學性能和蛋白附著量比較 實驗組和對照組間的力學性能比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；實驗組的蛋白附著量顯著低于對照組(P=0.000)，大約是對照組的10%。表1。

表1 2組試件力學性能和蛋白附著量比較(n=6)

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2 CFU計數比較 與對照組比較，實驗組的全菌、總鏈球菌和變形鏈球菌的CFU計數均降低了約7倍，差異比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表2。

表2 2組試件CFU計數比較(n=6)

注：與對照組比較，*P<0.05

2.3 表面細菌粘附的定性比較 對照組表面覆蓋大量活細菌，呈綠色熒光，實驗組雖然表面也呈綠色熒光，但是含量明顯低于對照組，圖1。

圖1 菌斑生物膜活/死細菌染色圖(n=6)

3 討論

口腔生物膜模型可以分為單一菌種、特定的混合菌和全菌模型3組[11]。從口腔環(huán)境中復制出來的全菌生物膜基本保持了口腔內菌斑生物膜的復雜性和異質性[12]。人唾液微生物中，鏈球菌在齲病發(fā)生發(fā)展過程中起了重要的作用。口腔鏈球菌包含多種菌群，如變形鏈球菌群、唾液鏈球菌群等。許多研究已經表明，變形鏈球菌是齲齒的主要致病菌[12]。變形鏈球菌組包含變形鏈球菌和遠緣鏈球菌等，都是重要的致齲菌。因此，體外培養(yǎng)口腔全菌生物膜，研究抗菌材料對菌斑生物膜的影響，對評價材料的性能及其臨床應用前景非常重要。

本研究將MPC和NACP添加到復合樹脂中，對其力學性能、抗蛋白附著和抗細菌粘附效果進行了評價。結果表明，與對照組比較，實驗組在不影響復合樹脂力學性能的前提下，顯著降低了蛋白附著量和細菌粘附量，因此添加了MPC-NACP的復合樹脂能夠有效減少蛋白質的附著和細菌的粘附，從而抑制菌斑形成，能夠有效的對抗繼發(fā)齲。

菌斑是引起繼發(fā)齲的主要原因[3]，而蛋白質的附著是細菌粘附和菌斑形成的先決條件[4]。因此，賦予復合樹脂抗蛋白附著功能可以有效地減少菌斑的形成。MPC具有較強的抗蛋白附著和抗細菌粘附的功能，其原因是由于MPC具有很強的親水性，在含水的MPC聚合物中有大量的游離水，而沒有結合水。結合水會導致蛋白質的附著，而游離水可以有效地抵抗蛋白質的附著[5-6]。本研究結果顯示，含有MPC的復合樹脂具有較強的抗蛋白附著功能，其蛋白質附著量約為對照組的10%。蛋白質是細菌粘附的媒介[4]，由于實驗組顯著降低了蛋白質附著量，因此也明顯減少了細菌的附著。本研究結果顯示，與對照組相比，實驗組的全菌、總鏈球菌和變形鏈球菌的3個CFU計數均降低了約7倍。生物膜活/死細菌染色顯示，實驗組表面粘附的細菌量明顯低于對照組。

研發(fā)具有再礦化功能的磷酸鈣復合樹脂是對抗繼發(fā)齲的另一個有效途徑。傳統(tǒng)的磷酸鈣填料粒徑在1～55μm。這類復合樹脂能夠釋放鈣、磷離子，

使病損牙體組織再礦化。霧化干燥技術合成的NACP具有高的比表面積，粒徑約為100 nm。由此產生的納米復合樹脂能釋放大量的鈣、磷離子，同時機械強度是傳統(tǒng)磷酸鈣復合樹脂的近2倍。NACP復合樹脂有一定的“智能性”，它在酸性環(huán)境里會大量釋放出鈣、磷離子，也就是在牙最需要鈣、磷離子以對抗細菌產酸和防止齲壞發(fā)展的鈣、磷離子最佳釋放時機。將NACP復合樹脂浸泡在pH值為4的酸性溶液里，它將會迅速中和酸，將pH值升高到6左右的安全范圍內，而成品的復合樹脂修復材料不會對pH值為4的酸性環(huán)境發(fā)生任何影響[7-8]。本研究同時添加MPC和NACP到復合樹脂中，能夠起到抗蛋白附著，抗細菌粘附，中和酸和促進再礦化的作用。這種添加雙重有效成分(MPC是抗蛋白附著成分，NACP是再礦化成分)的方法具有廣泛的應用前景。