葉酸代謝通路常見基因多態位點及其檢測方法

何震宇

(廣東藥科大學生物化學與分子生物學系，廣東 廣州 510006)

葉酸是一種人體必需的B族維生素，它在人體中經過兩步還原反應轉變為四氫葉酸(FH4)。FH4能夠攜帶一碳單位參與(脫氧)核苷酸的合成，從而間接參與核酸的合成。FH4可以轉變為N5,N10-亞甲四氫葉酸，N5,N10-亞甲四氫葉酸能被5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)進一步轉變為N5-甲基四氫葉酸(N5-CH3-FH4)。N5-CH3-FH4在甲硫氨酸合成酶的催化下提供甲基使同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)轉變成甲硫氨酸，同時釋放出游離的FH4，這步反應具有如下意義：(1)降低血液中同型半胱氨酸水平，而同型半胱氨酸為動脈粥樣硬化和冠心病發生的獨立危險因素；(2)促進FH4的再生；(3)甲硫氨酸可進一步轉變為S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，SAM為體內重要的甲基供體，很多重要的生理活性物質比如腎上腺素、肉堿、膽堿及肌酸等的合成需要它提供甲基，DNA、蛋白質等的甲基化也有賴于它[1]。甲硫氨酸合成酶發揮活性需要輔助因子維生素B12，但維生素B12容易氧化失活從而導致甲硫氨酸合成酶失活。甲硫氨酸合成酶還原酶(methionine synthase reductase，MSR)又叫5-甲基四氫葉酸-同型半胱氨酸甲基轉移酶還原酶(5-methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase reductase，MTRR)，它能使氧化型維生素B12發生甲基化還原生成有活性的維生素B12從而恢復甲硫氨酸合成酶的活性[2]。綜上所述，不難看出，葉酸代謝通路對維持人體健康至關重要，該代謝通路的關鍵酶MTHFR、MTRR如果存在遺傳缺陷的話，勢必會不同程度地影響人體健康。目前，對人體健康影響最大、受關注度最高的基因多態位點為MTHFR基因C677T、A1298C位點及MTRR基因A66G位點。

1 葉酸代謝常見基因多態位點及臨床意義

1.1 MTHFR基因C677T位點和A1298C位點

5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶的編碼基因MTHFR基因定位于1p36.3[3]，包含11個外顯子[4]。MTHFR基因錯義突變是引起酶活性缺乏和降低的主要機制，最常見的一個多態位點是C677T，它會導致多肽鏈相應的丙氨酸(Ala)被纈氨酸(Val)取代，從而降低MTHFR的熱穩定性和活性，在46 ℃加熱5 min的情況下，CC、CT、TT基因型樣品殘余的酶活性分別為67%、56%、22%；正常情況下，TT型樣品的活性約為CC型樣品的50%[5-6]。另一個常見的多態位點是A1298C，它由Viel A等[7]最先發現，該突變可導致多肽鏈中相應的谷氨酸(Glu)被丙氨酸(Ala)取代，使用淋巴細胞提取液測定酶活性時發現，CC型突變純合子的酶活性大約只有正常野生型純合子酶活性的60%，A1298C和C677T雙雜合子的酶活性為野生型的50%～60%[8]；使用體外表達的酶進行研究表明，相較于野生型酶，1298C單位點突變、677T單位點突變、1298C和677T雙位點突變酶的活性分別為68%、45%、41%[9]。

1.2 MTRR基因A66G位點

甲硫氨酸合成酶還原酶的編碼基因MTRR基因定位于5p15.2-15.3[10]，大約34 kb，包含15個外顯子[11]。

MTRR基因最常見的一個多態位點是A66G，它會導致多肽鏈第22位的異亮氨酸被甲硫氨酸取代(I22M)，體外研究表明，要想使甲硫氨酸合成酶達到最大反應速度，M22變異體相對于I22野生型酶而言，反應體系中使用甲硫氨酸合成酶還原酶與甲硫氨酸合成酶的比率要高3～4倍[2]，意味著該位點對甲硫氨酸合成酶還原酶的活性影響非常之大。

顯然，上述3個位點都會對其相應的酶活性造成較大影響，從而引起血漿同型半胱氨酸水平上升、一碳單位代謝障礙，與唐氏綜合征[12-13]、唇腭裂[14-15]、神經管缺陷[16-17]、心腦血管疾病[18-22]、自閉癥[23]、精神分裂癥[24]、腫瘤[25-26]、反復自然性流產[27]、男性不育[28]等多種疾病的發病風險增加相關。

中國人群C677T、A1298C和A66G多態位點基因型和等位基因頻率存在顯著的地理和種族差異[29]，見表1。因此，加強這3個位點的基因分型研究，對臨床疾病診斷及風險性預測具有重要意義。

2 針對葉酸代謝通路常見多態位點的檢測方法

2.1 聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)

該法先用PCR擴增包含多態位點的DNA片段，然后用相應的限制性核酸內切酶消化PCR產物，酶切產物再通過電泳予以分離，根據電泳圖譜中酶切片段的數目和大小判斷基因型。 其中MTHFR基因C677T位點關聯堿基序列GAGYC(Y=C或T)，突變型等位基因T的相應序列GAGTC能夠被限制性核酸內切酶HinfⅠ識別，反之，野生型等位基因C的相應序列GAGCC不能被HinfⅠ識別，從而可用HinfⅠ甄別該位點；MTHFR基因A1298C位點關聯堿基序列GAAGM(M=A或C)，野生型等位基因A的相應序列GAAGA能夠被限制性核酸內切酶MboⅡ識別，反之，突變型等位基因C的相應序列GAAGC不能被MboⅡ識別，從而可用MboⅡ鑒定該位點；MTRR基因A66G位點關聯堿基序列AATRTG(R=A或G)，本來沒有合適的限制性核酸內切酶甄別該序列，但通過錯配引物PCR將其變為CATRTG后，野生等位基因A的相應序列為CATATG，能被限制性核酸內切酶NdeⅠ識別，反之，突變型等位基因G的相應序列為CATGTG，不能被限制性核酸內切酶NdeⅠ識別，從而可以用NdeⅠ來鑒定該位點，這個位點采用了所謂的引物介導的限制性分析 PCR (PCR-primer introduced restriction analysis,PCR-PIRA)。Nasri等[30]在研究MTHFR基因C677T位點、A1298C位點及MTRR基因A66G 位點與神經管缺陷的關系時，基因分型采用的正是PCR-RFLP法。盡管PCR-RFLP法是一種經典的基因分型方法，操作簡單，對儀器設備要求低，但由于涉及酶切反應，酶切不完全容易導致基因型誤判，不過在PCR產物中引入內對照酶切位點可以克服這一缺點[31]。此外，目前針對3個位點的檢測需要使用3種不同的內切酶，難以在同一反應體系進行3個位點的酶切反應，若能實現3個位點的同管酶切檢測，必將大幅提高檢測效率。

表1 中國不同地區葉酸代謝基因主要多態位點突變等位基因及基因型頻率
Table1Mutant alleles and genotypes frequencies of major polymorphisms of folate metabolism genes in different regions of China

多態位點(突變等位基因在后)地區突變純合子基因型頻率/%突變等位基因頻率/%MTHFR基因 C677T南方7(5-8)25(23-27)中部19(16-21)41(36-45)北方28(25-31)53(51-55)MTHFR基因 A1298C南方7(5-9)28(24-31)中部4(3-4)18(17-19)北方3(2-3)17(16-19)MTRR基因A66G南方8(6-10)29(28-31)中部6(6-7)25(23-27)北方6(5-6)24(23-25)

2.2 擴增阻滯突變系統聚合酶鏈反應(amplication refractory mutation system-PCR，ARMS-PCR)

該法又叫等位基因特異性PCR(allele specific PCR，AS-PCR)，它使用針對每個位點的2種等位基因特異性引物即野生型引物PW和突變型引物PM配合常規引物進行PCR，通過電泳檢測PCR產物是否出現PW、PM特異的目的條帶來分辨基因型[32-33]。Lajin B等[34]使用該技術成功地建立了一種同管檢測MTHFR基因C677T位點、A1298C位點及MTRR基因A66G 位點3個位點的方法，并檢測了126例樣本。該方法只需PCR反應和常規的電泳就可檢測樣本基因型，簡便、快速、成本低，但影響特異性擴增的因素較多，PCR條件優化不當時容易造成基因分型錯誤。

2.3 測序(Sequencing)

Sanger測序(雙脫氧鏈終止法)是基因檢測的金標準，但需要昂貴的測序儀器和專業操作人員。Guo QN等[35]在一項研究中檢測了212名個體MTHFR基因C677T位點、A1298C位點及MTRR基因A66G 位點的基因型，它們均由專業測序公司采用Sanger測序法完成。

焦磷酸測序(Pyrosequencing)是可與Sanger測序媲美的另一種測序技術。其原理是：引物與模板DNA退火后，在4種酶的協同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯起來，通過檢測熒光的釋放和強度達到實時測定DNA序列的目的。該方法不僅需要昂貴的焦磷酸測序儀，而且測序反應體系中每種成分和參數的優化都比較麻煩。Roberto M等[36]在研究參與氟嘧啶代謝和5-氟尿嘧啶(5-FU)降解的基因的多態性時，使用該法檢測了142例胃腸道腫瘤患者的MTHFR基因C677T位點、A1298C位點的基因型。

2.4 實時熒光PCR (real-time PCR，RT-PCR)

該法是在PCR擴增過程中，通過熒光信號對PCR進程進行實時檢測的一種方法。在進行SNP分型時，PCR反應體系里除了引物外，還有探針，最常見的為Taqman探針，每個多態位點的2個等位基因各有其標記不同顏色熒光基團的特異性探針，未發生PCR擴增時，探針上一側的熒光會被探針上另一側的淬滅基團吸收，反應體系無法檢測到熒光，一旦發生PCR擴增，探針上的淬滅基團會被水解，熒光基團發出熒光隨即被檢測，最后根據檢測到的累積熒光就可判斷樣品的基因型。墨西哥學者在研究類風濕性關節炎的嚴重程度與相關單核苷酸多態性之間的潛在聯系時，就采用基于Taqman探針的實時熒光PCR檢測了MTHFR基因C677T位點、A1298C位點及MTRR基因A66G 位點的基因型[37]。王蘇梅等[ 38]使用該法檢測了100例樣本，與PCR-RFLP法比較，符合率96%。該法操作簡單、快速，但探針成本較高，且反應體系中引物、探針的濃度乃至DNA聚合酶的用量均需優化，給實驗增加了一定的難度。

2.5 高分辨熔解曲線技術( high-resolution melting，HRM)

該法在PCR反應體系中加入一種飽和熒光染料，該熒光染料能結合到雙鏈的DNA分子上，在PCR反應結束后，不斷升溫，使PCR產物上的熒光染料不斷脫落導致熒光信號下降，從而繪制出相應的熔解曲線，并根據熔解曲線的變化判斷樣本的基因型，因為不同基因型樣本PCR產物的堿基序列存在差異，解鏈行為不同導致熔解曲線存在差異。潘登等[39]使用該法檢測了96例樣本MTHFR基因C677T位點、A1298C位點及MTRR基因A66G 位點的基因型，分型結果與測序結果完全一致。李玲使用該法檢測了1 000份樣品，其中只有2例與測序結果不符，準確率99.8%[40]。HRM法操作簡便、快速，不需要探針，但對儀器溫度的均一性要求非常高，反應條件極為苛刻，必須反復摸索。

2.6 變性高效液相色譜(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)

該方法是先通過PCR獲得靶DNA分子，然后將DNA分子進行變性和復性，雜合子樣品在復性的過程中會形成同源雙鏈和異源雙鏈，在部分變性溫度條件下，異源雙鏈因有錯配區的存在而更易變性，在色譜柱中的保留時間少于同源雙鏈，故先被洗脫下來，出現2個峰或多個峰。李才明等[41]用此法檢測了334例南方漢族人的MTHFR基因C677T位點，CT基因型顯示為2個峰，而CC和TT基因型標本在單獨進樣時僅出現單峰，而將CC和TT基因型的PCR產物混合后再進樣，可出現與CT基因型標本類似的雙峰，經酶切和測序驗證，準確率99%以上。DHPLC檢測高效快速，但對所用試劑和環境要求較高，否則容易產生誤差。

2.7 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/Ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOFMS)

它是將PCR產物變性為單鏈后使用引物延伸單個堿基(多態位點堿基)，根據引物在延伸反應中所結合的不同堿基的不同質量在質譜儀上顯示不同峰而檢測SNP。該法分析速度快、準確度高，但需要昂貴的質譜儀，且對操作人員要求高。Suthandiram S等[42]使用Sequenom-MassARRAY平臺對372名非霍奇金淋巴瘤患者和722名對照者進行基因分型以研究MTHFR基因 C677T和A1298C單核苷酸多態性與非霍奇金淋巴瘤的患病風險。

2.8 DNA微陣列(DNA Microarray)

該技術在芯片上固定不同基因位點的特異性探針，然后與熒光標記的單鏈PCR產物進行雜交，通過雜交信號來判斷基因型。Gra O等[43]采用一種名叫“Pharmagen biochip”的DNA微陣列檢測了352名健康志愿者的MTHFR基因C677T位點、A1298C位點及MTRR基因A66G 位點的基因型。這類方法可一次性檢測出多個SNP位點，但特異性較差，樣品的制備和標記較為繁瑣，檢測成本高。

2.9 探針介導的重組酶擴增(probe-directed recombinase amplification，PDRA)

該方法雖然也涉及核酸的擴增，但屬于恒溫擴增，不需像PCR那樣設置溫度循環。它針對每個位點設立2個實時反應體系，每個反應體系包含一條序列一致的引物和一條等位基因特異的探針，此外，還含有單鏈結合蛋白SSB、重組酶UvsX、DNA 聚合酶、核酸外切酶Ⅲ等主要成分。當探針與靶DNA特異性雜交結合后，能夠被核酸外切酶Ⅲ在 多態位點3′端附近的一個人為引進的四氫呋喃位點發生切割，切割產生的5′端片段能充當引物，在SSB、UvsX、DNA 聚合酶的協同作用下完成靶序列的擴增，切下的3′端片段上的熒光基團則能發出熒光，通過相關儀器收集累積的熒光信號就能判斷基因型。Duan S等[44]使用該法檢測了150例先天性心臟病患者的MTHFR基因A1298C位點的基因型，擴增反應在39 ℃下35 min內便可完成，分型結果與直接測序完全吻合。本法操作簡便、快速，但引物的設計非常受限，引物的修飾標記比較麻煩，只能用于部分多態位點的基因分型。

2.10 PCR-金磁微粒層析法(PCR-gold magnetic nanoparticles-based lateral flow assay)

該法先利用AMRS-PCR對樣品進行擴增，PCR產物兩端分別帶有地高辛及生物素標記，它們經過金磁微粒層析系統時，與層析體系中的偶聯地高辛單抗的金磁微粒及鏈親和素結合形成復合物，在層析試紙條的檢測線處聚集大量磁粒，進而呈現紅色條帶，無擴增結果則在檢測線上無條帶呈現。Hui W等[45]使用該法檢測了1 721例標本，分型結果與測序結果吻合率高達99.6%。本法操作簡單，無需大型貴重儀器，PCR結束后10 min內可得到目視化結果，但引物標記、金磁微粒層析系統成本不菲，而且也難以避免AMRS-PCR本身的弊端。

綜上所述,目前對葉酸代謝通路3個主要單核苷酸多態位點的檢測方法較多，各有其優缺點，在各種科學研究及臨床檢測中，應綜合考慮實驗成本、實驗周期、結果的準確性及相應的儀器、設備條件，選擇合適的分型方法。