熱毒寧注射液治療新型冠狀病毒肺炎的活性成分與潛在作用機制初探

陳元堃，曾奧，羅振輝，何樹苗，李春梅，盧群

(廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)具傳染性強、傳播迅速、各類人群均易感等特點，其傳播的途徑主要包括了飛沫、接觸、糞口等[1]。輕度感染患者表現為發熱、干咳及乏力等癥狀，而重度患者可出現嚴重的急性呼吸衰竭、膿毒癥、腎衰甚至死亡等[2-3]。到目前為止仍無治療COVID-19的特效方法，主要采用中西醫臨床對癥治療的方式來應對[4-5]。

在疫情防治中中醫的整體觀及辨證論治特點優勢十分顯著，在國家健康委辦公廳印發的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第6版)》中，就包含了熱毒寧注射液[6]。熱毒寧注射液主要由梔子、金銀花、青蒿等三味中藥組成，多應用在外感風熱所引起的上呼吸道感染、咳嗽、微惡風寒、感冒等[7]，對多種病毒具有抑制作用，如肺內鼠巨細胞病毒、CVA16、甲型HIN1等[8]；相關機構藥效篩選后初步發現熱毒寧、金振口服液等中成藥在體外具有抑制SARS-CoV-2的作用。本研究利用網絡藥理學的方法篩選出熱毒寧注射液中的核心成分，并通過分析軟件進一步探討其與受體的分子對接結果和信號通路等，從而對治療COVID-19的作用機制進行預測，為傳統中醫藥治療COVID-19提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 熱毒寧中主要中藥成分的獲取及篩選

通過中藥系統藥理學數據庫及在線分析平臺(http://tcmspw.com/tcmsp.php,TCMSP)收集青蒿、金銀花、梔子的主要活性成分。口服生物利用度(OB)為藥物的吸收、分布、代謝及排泄中的重要藥代學參數之一，主要指口服藥物中的有效成分和活性基等進入人體循環并被吸收的速度及程度，而OB值越高則代表此藥物的生物活性、類藥性(DL)越佳[9-10]。故本文以OB≥30%、DL≥0.18作為篩選條件來篩選出候選的活性成分。

1.2 預測COVID-19相關靶點

將“novel coronavirus pneumonia”作為檢索關鍵詞，選擇“Homo sapiens”物種，通過GeneCards數據庫獲得與COVID-19相關的基因。

1.3 潛在靶點的預測及篩選重合靶點

通過TCMSP平臺檢索獲得青蒿、金銀花、梔子的靶蛋白，并利用Perl腳本篩選出候選活性成分的靶蛋白，剔除沒有對應活性成分的靶蛋白，并將靶蛋白標準化建立數據集。通過R語言將上文獲得的COVID-19相關的靶點與藥物候選靶點取交集用于以下的分析。將獲得的交集部分以及中藥、候選活性成分整合為“network”、“node”文件，將其導入Cytoscape_v3.7.2中構建藥物-活性成分-交集靶點的網絡圖。

1.4 蛋白互作網絡的構建與分析

對獲得的疾病與藥物的共同靶點導入STRING進行分析，物種選擇“Homo sapiens”，將置信度>0.7作為篩選指標。將獲得的結果導入Cytoscape_v3.7.2進行蛋白-蛋白(PPI)互作模型的建立，并使用其中的分析工具(Network analyzer)及插件(MCODE)分析PPI網絡。

1.5 KEGG和GO富集分析

利用DAVID平臺進行GO及KEGG的富集分析，分析靶點涉及的基因功能及相應的信號通路，以P<0.05為篩選指標，并利用R語言將其可視化。

1.6 分子對接

從PDB數據庫中下載目標蛋白的PDB文件，并用Discovery Studio 4.5 Client對目標蛋白進行刪除水、加氫、確定對接位點等操作。利用ChemBio Draw Ultra 14.0、ChemBio3D Ultra 14.0畫出關鍵化合物的化學結構，并將其轉化為pbdqt格式。利用vina完成受體與配體的對接[11]，結合能若小于0表明受體與配體能夠自發的結合，當前篩選活性靶點還沒有統一的標準，故依據文獻報道本文將結合能≤5作為篩選熱毒寧注射液治療COVID-19的活性成分[12-13]。

2 結果

2.1 收集、篩選熱毒寧注射液活性成分及COVID-19潛在靶點

通過TCMSP數據庫檢索收集到青蒿126個成分，梔子98個成分，金銀花236個成分。對得到的各中藥中化學成分依據OB≥30%、DL≥0.18進行篩選，并剔除沒有靶蛋白的化學成分，共得到50個有效的化學成分。在這些活性成分中，有的同時存在于3種中藥中，如β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、槲皮素(quercetin)等(見圖1)。同時，通過Genecards收集到COVID-19相關靶點共251個。

圖1熱毒寧注射液中藥物-活性成分網絡圖

Figure1Drug-active ingredient network of Reduning injection

2.2 熱毒寧注射液治療COVID-19的潛在靶點

利用TCMSP數據庫收集得到金銀花、青蒿、梔子中50個化學成分的對應靶點共231個。在藥物對靶點中，存在多個藥物共同擁有多個靶點的情況；以及在藥物活性成分對應的靶點中，存在一個活性成分對應多個靶點及多個活性成分對應一個靶點的情況。利用Perl腳本取熱毒寧注射液中活性成分對應靶點與COVID-19相關靶點的交集之后，共得到43個熱毒寧治療COVID-19的潛在靶點。

2.3 構建及分析藥物-活性成分-靶點網絡

利用Cytoscape_v3.7.2構建“藥物-活性成分-作用靶點”網絡，見圖2。網絡中有70個節點及161條邊，節點為活性成分及治療靶點基因，邊為它們之間相互作用的關系。從圖2中可以發現一個活性成分對多個靶點起作用，且還存在多個活性成分對一個靶點有作用，這就體現了熱毒寧注射液多成分、多靶點相互協同治療COVID-19的特點。

2.4 蛋白互作網絡的構建與分析

通過STRING構建的蛋白質之間的相互作用關系網絡見圖3。此網絡圖中有43個節點與459條邊，圖中節點越大表明其度值越大，邊越粗表明其評分越高及關系越密切，顏色的深淺與度值及介值呈正相關的關系。在PPI網絡圖拓撲屬性分析后得出，IL-6、CASP3等度值大于平均節點度值，確定為這一網絡的核心靶點，之后利用MCODE分析得到2個具有顯著性的子模塊。模塊1評分為20.000，包括22個節點與210條邊，以上提到的核心靶點都包含在內；模塊2評分為4.333，包括7個節點與13條邊。見圖3。

注：綠色-金銀花; 紫色-青蒿;黃色-梔子; 多藥物-紅色; 藍色-基因。

圖2熱毒寧注射液藥物-活性成分-靶點網絡

Figure2Drug-active ingredient-target network of Reduning injection

2.5 GO富集分析

GO富集分析后共得到125個富集的結果。其中生物過程(BP)有95個，主要涉及有RNA聚合酶Ⅱ啟動子對轉錄的正向調控(positive regulation of transcription from rna polymerase ii promoter)、免疫反應(immune response)、炎癥反應(inflammtory response)等方面。細胞成分(CC)有12個，主要涉及有細胞核(nucleus)、胞液(cytosol)等。分子功能(MF)有15個，主要涉及到蛋白質同源二聚化活性(protein homodimerization activity)、細胞因子活性(cytokine activity)等。本文選出BP、CC、MF的前10項富集結果做圖4。

2.6 KEGG富集分析

KEGG富集分析后，得到104條富集結果，包括信號轉導通路(TNF signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、HIF-1 signaling pathway)、毒感染相關通路(Influenza A、HTLV-I infection、Herpes simplex infection)、腫瘤相關通路(Pancreatic cancer、Small cell lung cancer)等，說明熱毒寧注射液可能通過以上通路對COVID-19有作用。本文選出KEGG的前10項富集結果作圖5。

2.7 分子對接

目前，多數研究認為配體與受體在結合構象穩定的情況下能量越低就表明此受體與配體發生作用的可能越大。通過對接后發現，芹菜素、木犀草素與SARS-CoV-23CL水解酶結合的能量最低，分別為-32.21 7kJ/mol、-30.962 kJ/mol。此次研究中的主要成分與SARS-CoV-23CL水解酶的結合能都遠遠小于-5 kJ/mol，與目前報道中具有抗COVID-19作用的化學藥物瑞德西韋、利托那韋等相似，具體見表1。以上結果表明熱毒寧注射液中的主要成分與SARS-CoV-23CL水解酶的結合形成的構象能量極低、結構較穩定、活性高，具體對接情況見圖6。

模塊1模塊2

圖3蛋白互作網絡
Figure3Protein interaction network

圖4GO富集結果
Figure4GO enrichment results

圖5KEGG富集結果
Figure5KEGG enrichment results

3 討論

本研究篩選出熱毒寧注射液中符合標準的成分有50個，對應的靶點有231個，與COVID-19重合的有43個，表明了熱毒寧注射液通過多成分、多靶點的方式來防治COVID-19。

從藥物-活性成分-靶點網絡中發現，涉及靶點最多的化合物均屬于黃酮類化合物，主要為芹菜素(Apigenin)、槲皮素(Quercetin)、木犀草素(Luteolin)，且這3種化合物度值均較大，表明其可能為發揮防治作用的主要化合物。多項研究指出，

表1 熱毒寧注射液關鍵成分與抗COVID-19化學藥物與SARS-CoV-23CL水解酶的結合能
Table1Binding energy of key components in Reduning injection and anti-COVID-19 chemical drug with SARS-CoV-23CL hydrolase

NO化合物化學式相對分子質量CASSARS-CoV-2結合能/(kJ·mol-1)1芹菜素C15H10O5270.24520-36-53CL水解酶-32.2172木犀草素C15H10O6286.24491-70-33CL水解酶-30.9623槲皮素C15H14O9338.276151-25-33CL水解酶-30.5434山奈酚C15H10O6286.24520-18-33CL水解酶-30.5435異鼠李素C16H12O7316.26480-19-33CL水解酶-30.5436馬錢苷酸C16H24O10376.3622255-40-93CL水解酶-29.7067豆甾醇C29H48O412.6983-48-73CL水解酶-28.900 8β-谷甾醇C29H50O414.7183-46-53CL水解酶-27.2169瑞德西韋C27H35N6O8P602.581809249-37-33CL水解酶-32.63510利托那韋C37H48N6O5S2720.96155213-67-53CL水解酶-31.79811洛匹那韋C37H48N4O5628.8192725-17-03CL水解酶-30.96212硝唑尼特C12H9N3O5S307.2855981-09-43CL水解酶-27.19613利巴韋林C8H12N4O5244.236791-04-53CL水解酶-25.10414氯喹C18H26ClN3319.87198513CL水解酶-24.267

圖6SARS-CoV-23CL以及ACE2與芹菜素和木犀草素分子對接情況
Figure6SARS-CoV-23CL hydrolase and ACE2 docking with Apigenin and Luteolin

黃酮類化合物對柯薩奇病毒、流感病毒及乙肝病毒在內的多種病毒具有較強的抵抗作用[14]。芹菜素是一種潛力極大的天然化合物，其具有抗炎、抗癌、抗菌及抗病毒等多種功效[15]，對口蹄疫病毒有較強的抑制作用，且可阻礙病毒的翻譯活動[16]。木犀草素因結構中含5-OH等，故表現出優越的抗病毒效果，如其對HIV-1中的蛋白酶及整合酶有較強的抑制作用，還具有抗腫瘤、抗炎鎮痛、抗菌、調節免疫系統的作用[17]。此外，槲皮素是一種明星化合物，近幾年來對其研究較多[18]。槲皮素可通過阻礙病毒受體復合物進入機體細胞內，阻斷病毒的生活周期，最后導致其死亡[19]。LEE等[20]指出，槲皮素可通過抑制TLR-3的表達來影響炎癥轉錄因子，從而起到抗HSV-1的效果。綜上所述，熱毒寧注射液中主要化合物均具較強的抑制病毒作用，進一步證明了熱毒注射液的抗病毒功效。

在PPI網絡圖中，度值大于節點平均度值的靶點有IL-6、CASP3、MAPK8、MAPK1等。IL-6為機體內參與信息傳遞及調節激活免疫細胞的一種細胞因子，IL-6的表達失調會導致多種疾病的發生[21]。程林等[22]發現，在HIV患者體內sPD-1的過表達可能與HIV-1誘導IL-6分泌有關，從而使患者免疫系統清除HIV-1這一活動受到阻礙。昌仲勇等[23]發現聯合血清IL-6、hs-CRP、PCT檢查對COVID-19患者的預后及死亡風險具有很好的判斷作用。CASP3為多條凋亡途徑下游的共同效應成分，在多種細胞的凋亡中處于核心地位，被認為是執行死亡的蛋白酶。藥物可通過影響CASP3從而起到抗病毒、抗腫瘤等作用[24]。劉曉婷等[25]發現黃芩苷可通過影響CASP3與CASP8的表達來改善流感病毒誘導細胞凋亡的情況。MAPK8、MAPK1均屬于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族里的成員，其可在多種環境應激中被激活，如DNA損傷、氧化應激、病毒感染、癌癥等[26]。MIZUTANI等[27]發現在SARS-CoV感染的細胞中P38MAPK、MAPKAPK-2、HSP-27、CREB、eIF4E的下游靶點均可被磷酸化，同時在其他冠狀病毒的感染中MAPK家族成員也可被激活。

GO與KEGG的富集結果主要涉及細菌感染、病毒感染、腫瘤等方面，說明熱毒寧注射液中的多種活性組分可能通過對COVID-19中失衡的通路進行協同調控，從而起到防治的作用。陳躍宣等[28]利用熱毒寧聯合阿奇霉素治療支原體肺炎的患者時發現，兩者聯合治療時療效好且可使患者血清中的促炎因子、抗炎因子及細胞的免疫指標得到改善。趙志勇等[29]得出用熱毒寧與大劑量的丙種球蛋白來聯合治療患兒的急性重癥病毒性肺炎的療效好、安全性高、預后佳，且較以往的病程大大縮短。本研究得出結果進一步證實了熱毒寧注射液在肺部疾病中的療效。

從分子對接的結果可知，芹菜素、木犀草素、槲皮素、山奈酚等與目前臨床上推薦的對COVID-19有效的化學藥物的結合能相近。有研究提出，SARS-CoV-2及SARS-CoV表達的S蛋白與機體中的血管緊張素轉化酶(ACE2)結合后可使病毒入侵，從而進一步導致疾病的發生。因此，本研究將熱毒寧注射液中的主要成分(芹菜素、木犀草素)與ACE2來進行分子對接。對接后發現芹菜素、木犀草素與ACE2的結合能均小于-5，分別為24.267 kJ/mol、23.849 kJ/mol。

綜上所述，研究中結合網絡藥理學與分子對接的方法對熱毒寧注射液抗COVID-19的化學成分、靶點、作用機制以及主要成分與SARS-CoV-2水解酶和ACE2的結合能作出了初步的預測，為日后的抗新型肺炎藥物的研發提供了一個思路。但本研究還存在有一定的局限性，如數據庫不完整、忽略了中藥中成分的含量、在機體內其他藥代動力學的作用等。對于以上存在的這些問題，后期可通過進行藥效和臨床治療效果的探究，更深入地驗證，為新藥物的研發提供新思路及方向。