加味芪黃飲激活I(lǐng)nsR-IRS-1-PI3K-GLUT4信號(hào)通路延緩糖尿病腎病的研究

趙威，蒙向欣，李娟，李輝遠(yuǎn)

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院腎病科，廣東 廣州 510130)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎臟病的常見(jiàn)原因之一，嚴(yán)重危害患者的生命健康[1]。研究表明，胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是糖尿病患者的重要臨床特征，同時(shí)也是DN發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。胰島素受體(insulin receptor,InsR)、胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(glucose transporter 4,GLUT4)是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要組分，其組成的InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4信號(hào)通路與IR密切相關(guān)[3]。前期研究表明，具有“益氣養(yǎng)腎、化瘀清利”功效的自擬方——加味芪黃飲在治療DN中療效確切[4-6]，但其具體機(jī)制目前尚未闡明。本文擬通過(guò)觀察加味芪黃飲對(duì)DN大鼠的治療作用，研究其對(duì)IR狀態(tài)和InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4信號(hào)通路的影響，以期為加味芪黃飲治療DN提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3月齡雄性Sprague-Dawley大鼠，40只，SPF級(jí)，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2016-0041。

1.1.2 試劑與儀器 加味芪黃飲由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中藥制劑室提供；鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(美國(guó)Sigma公司)；碘(125I)胰島素放射免疫分析藥盒(北京科美東雅公司)；兔抗鼠InsR多克隆抗體、兔抗鼠IRS-1多克隆抗體、兔抗鼠PI3K多克隆抗體、兔抗鼠GLUT4多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)；辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(美國(guó)CST公司)；RM2135型石蠟切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)；IX71型普通熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)腎病大鼠模型[7]大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組(n=10)和DN組(n=30)。正常組：大鼠全程予普通飼料喂養(yǎng)。DN組：大鼠全程予高糖高脂飲食(66.5%常規(guī)飼料+20%蔗糖+10%豬油+2.5%膽固醇+1%膽酸鹽)，喂養(yǎng)8周后，禁食24 h，空腹?fàn)顟B(tài)下以1% STZ按45 mg/kg一次性腹腔注射，正常組大鼠予等量枸櫞酸鉀緩沖液處理。1周后，尾靜脈取血測(cè)定大鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)水平，當(dāng)FBG>13.9 mmol/L時(shí)，表明T2DM模型建立成功(共30只)。STZ注射后2周，代謝籠收集兩組大鼠24 h尿液，檢測(cè)24 h尿白蛋白(24-hour urinary albumin,24 h UAlb)水平，當(dāng)24 h UAlb>正常組均值3倍時(shí)，表明T2DM腎病模型制備成功[8]。

1.2.2 分組及給藥方法 將T2DM腎病大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、加味芪黃飲低、高劑量組(以下簡(jiǎn)稱低劑量組、高劑量組)，每組各10只。低、高劑量組大鼠每日分別予加味芪黃飲400 mg/kg、800 mg/kg灌胃治療，正常組、模型組大鼠則分別予等量生理鹽水處理，總療程共12周。

1.2.3 血、尿生化指標(biāo)檢測(cè) 12周后檢殺大鼠，代謝籠收集24 h尿液行24 h UAlb定量；尾靜脈取血，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各大鼠血肌酐(serum creatinine,Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、FBG等指標(biāo)，放射免疫法檢測(cè)大鼠空腹胰島素(fasting insulin,FIns)水平，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR),HOMA-IR=FIns×FBG/22.5。

1.2.4 腎組織HE染色檢查及MEI評(píng)分 留取大鼠腎組織標(biāo)本，以4%(φ)多聚甲醛固定、石蠟包埋后，制成厚度2 μm組織切片并行HE染色，光鏡下觀察腎組織病理變化。按文獻(xiàn)[9]描述的方法，半定量腎小球系膜增生指數(shù)(mesangial expansion index,MEI)：200倍光鏡下，每張切片隨機(jī)選擇15個(gè)腎小球，每個(gè)腎小球按系膜增生程度分為0～3分(0：正常腎小球；1：腎小球基質(zhì)增生達(dá)0～50%；2：腎小球基質(zhì)增生達(dá)50%～75%；3：腎小球基質(zhì)增生達(dá)75%～100%)，取其均值作為每組大鼠的MEI評(píng)分。

1.2.5 免疫組化檢測(cè)腎組織中InsR、IRS-1、PI3K、GLUT4蛋白表達(dá) 取2 μm腎組織切片常規(guī)脫蠟、水化，3% H2O2室溫孵育5 min；將切片浸泡于0.01 mol/L枸櫞酸鈉溶液(pH 6.0)中，高溫(95 ℃，10 min)抗原修復(fù)；10%(φ) BSA室溫封閉10 min，分別滴加兔抗鼠InsR一抗(1∶100)、IRS-1一抗(1∶100)、PI3K一抗(1∶100)和GLUT4一抗(1∶100)，濕盒內(nèi)4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；繼而分別滴加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)，濕盒內(nèi)室溫孵育60 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。按文獻(xiàn)[10]描述的方法，每例切片在200倍光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)不連續(xù)視野，利用高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)，測(cè)定腎組織中上述相關(guān)蛋白吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠24 h UAlb、Scr、BUN、FBG、FIns、 HOMA-IR測(cè)定

與正常組比較，模型組大鼠24 h UAlb、Scr、BUN、FBG、FIns、HOMA-IR水平均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，加味芪黃飲低、高劑量組大鼠24 h UAlb、Scr、BUN、FBG、FIns、HOMA-IR均降低(P<0.05)，且隨劑量增大，其下降趨勢(shì)更為顯著(P<0.05)(表1、表2)。

2.2 各組大鼠腎組織病理變化及MEI評(píng)分

HE染色觀察腎組織病理變化，正常組大鼠：腎小球結(jié)構(gòu)正常，腎小球基底膜、系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)未見(jiàn)明顯增生，腎小管形態(tài)正常。模型組大鼠：腎小球肥大，腎小囊腔狹窄呈裂隙狀，腎小球基底膜、系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)彌漫性增生，腎小管上皮細(xì)胞可見(jiàn)空泡和顆粒變性。低劑量組、高劑量組大鼠：腎小球和腎小管病理?yè)p傷程度均較模型組減輕，且隨藥物劑量增加，減輕程度更顯著(圖1)。半定量各組大鼠MEI評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 各組大鼠腎組織中InsR、IRS-1、PI3K、GLUT4蛋白表達(dá)

與正常組比較，模型組大鼠上述相關(guān)蛋白表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，加味芪黃飲低、高劑量組上述蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，且隨劑量增大，各蛋白升高程度更趨明顯(P<0.05)(圖3，表3)。

表1 各組大鼠24 h UAlb、Scr、BUN測(cè)定Table 1 Levels of 24 h UAlb,Scr and BUN of rats in each

與正常組比較:*P<0.01； 與模型組比較:#P<0.05； 與低劑量組比較：△P<0.05。

表2 各組大鼠FBG、FIns、HOMA-IR測(cè)定Table 2 Levels of FBG,FIns and HOMA-IR of rats in each

與正常組比較:*P<0.01； 與模型組比較:#P<0.05； 與低劑量組比較：△P<0.05。

注：圖A、B、C、D：200×； 圖 E、F、G、H：400×

圖1各組大鼠腎組織病理改變(HE染色)
Figure1Pathologic morphology in renal tissue of rats in each group (HE staining)

正常組模型組低劑量組高劑量組3.53.02.52.01.51.00.50.0MEI*##△

與正常組比較：*P<0.01； 與模型組比較:#P<0.05；與低劑量組比較：△P<0.05。

圖2各組大鼠腎小球MEI評(píng)分

3 討論

隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，DN在人群中的發(fā)病率日益增高，不僅嚴(yán)重危害人類(lèi)身體健康，也給社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[11]。DN屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“消渴”“水腫”“尿濁”“虛勞”等病范疇，其多為本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛責(zé)之肝、脾、腎虛，標(biāo)實(shí)則多為痰濕、濕濁、淤血，故其治療當(dāng)以補(bǔ)益肝脾腎為本，固其封藏，正其開(kāi)闔，兼以祛痰除濕，活血化瘀。加味芪黃飲是本研究小組根據(jù)祖國(guó)醫(yī)學(xué)治療消渴虛勞之名方——六味地黃丸化裁而來(lái)，方中以黃芪為君，取其補(bǔ)氣健脾，利水祛濕，攝血藏精之效；輔以太子參補(bǔ)中益氣，生津復(fù)血；生地黃滋補(bǔ)腎陰，兼清虛熱；山茱萸滋補(bǔ)肝腎，澀精固脫；山藥、茯苓健脾補(bǔ)虛，澤瀉利濕泄?jié)幔てぁ⑾S草清熱解毒，女貞子、白茅根、蟬蛻止血，諸藥相伍，共奏“益氣養(yǎng)腎、化瘀清利”之功。本研究采用加味芪黃飲治療DN大鼠，可降低大鼠24 h UAlb、Scr、BUN水平，改善腎組織病理?yè)p傷程度及MEI評(píng)分，這與前期的研究結(jié)果一致[4-6]，說(shuō)明加味芪黃飲治療DN療效確切。

IR是糖尿病的重要病理表現(xiàn)，是指胰島素作用的靶器官對(duì)胰島素的敏感性降低，機(jī)體需要過(guò)量的胰島素才能發(fā)揮生物效應(yīng)的一種狀態(tài)[12]。HOMA-IR是評(píng)估IR狀態(tài)的重要指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加味芪黃飲治療DN大鼠，可降低大鼠FBG及FIns水平，從而降低HOMA-IR，改善DN大鼠的IR狀態(tài)。IR在DN的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，在DN大鼠模型中，IR可通過(guò)促進(jìn)IL-1、IL-6等相關(guān)炎癥因子表達(dá)，導(dǎo)致大鼠血肌酐、尿蛋白水平升高[13]。在DN小鼠模型中，IR可通過(guò)促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增生，加重腎組織病理?yè)p傷[14]。因此猜想：加味芪黃飲可能通過(guò)改善DN的IR狀態(tài)，從而延緩DN的進(jìn)展。

InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的重要通路，其表達(dá)水平高低與IR狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)[15]。正常情況下，當(dāng)胰島素抵達(dá)靶細(xì)胞時(shí)，可先與靶細(xì)胞上的InsR結(jié)合并引起InsR磷酸化，磷酸化的InsR一方面為其他分子提供結(jié)合位點(diǎn)，另一方面可磷酸化其下游的IRS-1，磷酸化的IRS-1進(jìn)一步激活其下游的PI3K，使信號(hào)以激酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)下傳，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GLUT4合成、分泌、移位，GLUT4是直接影響葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞的因子，直接影響血糖的調(diào)節(jié)[16-17]。

圖3各組大鼠腎組織中InsR、IRS-1、PI3K、GLUT4蛋白表達(dá)(DAB顯色，200×)
Figure3Expression of InsR,IRS-1,PI3K and GLUT4 in renal tissue of rats in each group (200×)

表1 各組大鼠腎組織中InsR、IRS-1、PI3K、GLUT4吸光度值Table 1 Absorbance values of InsR,IRS-1,PI3K and GLUT4 in renal tissue of rats in each group

與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較:#P<0.05；與低劑量組比較：△P<0.05。

本研究結(jié)果顯示，模型組與正常組大鼠相比，InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4通路中各蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，使用加味芪黃飲治療后，上述各蛋白表達(dá)水平升高，且該效應(yīng)具有一定量效關(guān)系，提示加味芪黃飲可能通過(guò)激活I(lǐng)nsR/IRS-1/PI3K/GLUT4信號(hào)通路，進(jìn)而改善IR狀態(tài)。

綜上所述，加味芪黃飲治療DN療效確切，其可能通過(guò)激活I(lǐng)nsR/IRS-1/PI3K/GLUT4信號(hào)通路，改善IR狀態(tài)，最終延緩DN進(jìn)展。