基于網絡藥理學聯合GEO芯片分析干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病的機理和分子靶點

張澤鑫,吳汶豐,謝丹,方舒涵,徐筍晶

(1.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院,廣東 廣州 510405; 2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院傷寒教研室,廣東 廣州 510405)

2型糖尿病是以慢性高血糖為主的代謝性疾病，其病因和發病機制復雜，暫無特效穩定的治療與預防方法[1]。然而2型糖尿病在我國的發病人數不斷增多，預計在2030年將達到4 200萬[2]，且其并發癥及死亡率也不斷攀升，亟待尋求有效的預防與降糖治療方案。隨著中醫藥控制2型糖尿病患者血糖的效果越發顯著且副作用較小，采用中醫藥治療2型糖尿病也日益成為現在的研究重點。

2型糖尿病在中醫屬“消渴”范疇，其最核心的病機便是中滿內熱，脾氣損傷。由于現代人多食肥甘厚味，脾胃功能受損，運化失常，因而食郁體內致使濕熱內阻，熱耗而虛，從而導致糖尿病的發生發展[3]。干姜黃芩黃連人參湯出自《金匱要略》，主治寒熱虛實錯雜之嘔吐。其中干姜味辛善于升發宣散，人參味甘善于益氣，屬陽；黃連、黃芩味苦能降逆泄下，屬陰。將辛溫的干姜、甘溫的人參與苦寒的黃連、黃芩進行配伍，“一開一降,一補一泄”，與2型糖尿病脾虛胃熱，脾胃升降功能失調病機契合，因此干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病，寒溫并用,升降同施，效果顯著[4]。現代藥理學研究表明，干姜中的姜酚有抗氧化、降血脂、抗動脈粥樣硬化、保護胃黏膜、消炎鎮咳等功能[5]；予姜汁給STZ所致的糖尿病大鼠能顯著降低其禁食后血糖水平,并且升高胰島素在體內的水平[6]。黃連有止嘔等作用，且能提高胰島素作用的敏感性[7]。黃連中成分槲皮素、黃芩成分中黃芩素和人參中成分山奈酚同屬黃酮類化合物，皆可顯著降低患者的血糖水平[8-9]。基礎研究已經顯示以上藥物的一些通路靶點，但目前對于干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病的機理和分子靶點仍尚未完全研究清楚。

網絡藥理學可詮釋藥物“成分—靶點—通路”的整體調節機制，能對藥物與疾病的相關性進行預測，對研究中藥的多角度作用機制意義重大[10]。GEO數據庫是將精選的基因表達數據集以及原始系列和平臺記錄存儲在基因表達綜合庫，結合網絡藥理學能實現藥物治療疾病機理和分子靶點的闡釋。故本研究將通過網絡藥理學聯合GEO分析的方法，探求干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病的機理和分子靶點。

1 材料與方法

1.1 活性成分篩選

在TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)中分別檢索干姜、黃芩、黃連、人參。傳統中藥多為口服制劑，在人體必然經過吸收、分布、代謝、排泄(ADME)過程才能與靶器官、靶組織結合發揮藥效。而經驗表明，符合里賓斯基(Lipinski)的類藥五原則的先導藥物因具有較好的ADME性質而成為潛在的口服藥[11]。故將口服生物利用度(OB)設置為≥30%，類藥性(DL)設置為≥0.18，限定物種為“Homo sapiens”，以得到其活性成分。

1.2 靶點篩選

在Drugbank數據庫中(https://www.drugbank.ca/)導入干姜黃芩黃連人參湯的活性成分，獲取對應靶點。

1.3 2型糖尿病GEO芯片熱圖與火山圖繪制

從GEO數據庫下載GSE29221芯片與平臺數據，使用R軟件，設定 P value<0.005 and |log2(fold change)|>1，繪制熱圖與火山圖，將疾病的差異基因導入到excel表格中。

1.4 治療2型糖尿病分子基因網絡圖繪制

將干姜黃芩黃連人參湯與2型糖尿病的差異基因取交集后，導入到cytoscape3.7.2中，繪制分子基因網絡圖，尋找重要的活性分子。

1.5 治療2型糖尿病基因的拓撲網絡構建

將干姜黃芩黃連人參湯與2型糖尿病的差異基因取交集后，導入到cytoscape3.7.2中，使用Bisogenet和CytoNCA，設置計算度中心度(DC)>61，中間度中心度BC>600,構建其拓撲網絡，找出重要的候選基因(紅色矩形代表最后篩選出的核心基因)。

1.6 治療2型糖尿病基因GO富集分析

使用R軟件，根據干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因，進行GO富集分析。根據基因富集數目與顯著程度(pvalueCutoff <0.05,qvalueCutoff<0.05)，選取排名靠前的20條GO生物過程，繪制柱狀圖。

1.7 治療2型糖尿病基因KEGG富集分析

使用R軟件(此分析程序通過安裝colorspace、stringi、ggplot2、DOSE、clusterProfiler、enrichplot等6個packages進行)，根據干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因，進行KEGG富集分析。根據基因富集數目與顯著程度(pvalueCutoff<0.05,qvalueCutoff <0.05)，選取排名靠前的20條KEGG通路，繪制柱狀圖。

1.8 治療2型糖尿病通路與基因網絡圖繪制

將上述KEGG通路導入到cytoscape3.7.2中，根據degree值大小，顯示通路與基因的富集程度，繪制網絡圖。

2 結果

2.1 干姜黃芩黃連人參湯活性成分與靶點

將口服生物利用度(OB)設置為≥30%，類藥性(DL)設置為≥0.18，得到與2型糖尿病相關干姜活性成分19個，黃芩20個。黃連7個，人參3個。Drugbank顯示成分基因1 078個。結果見表1。

2.2 2型糖尿病GEO芯片熱圖與火山圖繪制

從GEO數據庫下載GSE29221芯片與平臺數據，共24個樣本，使用R軟件，繪制熱圖與火山圖，將疾病的差異基因導入到excel表格中。顏色深度代表基因表達程度，顏色越紅，基因表達更顯著；顏色更綠，基因表達更不顯著。見圖2。

2.3 干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病分子基因網絡圖

將干姜黃芩黃連人參湯與2型糖尿病的差異基因取交集后，導入到cytoscape3.7.2中，繪制分子基因網絡圖(圖3)，分子MOL00098對應最多的靶點，故可認為是干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病的主要分子。

表1 干姜黃芩黃連人參湯活性成分表Table 1 Active components in GHHR formula

表1 (續)

圖1正常人與2型糖尿病患者差異基因熱圖

Figure1Heat map of differential genes between normal and type 2 diabetic patients

0510-10-586420logFC-log10(P.value)

圖2正常人與2型糖尿病患者差異基因火山圖

Figure2Volcano map of differential genes between normal and type 2 diabetic patients

圖3干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病分子基因網絡圖

Figure3Molecular gene network diagram of GHHR formula for the treatment of type 2 diabetes

2.4 干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因的拓撲網絡圖

將干姜黃芩黃連人參湯與2型糖尿病的差異基因取交集后，導入到cytoscape3.7.2中，使用Bisogenet和CytoNCA，設置計算度中心度(DC)>61，中間度中心度(BC)>600,構建其拓撲網絡。從圖4C可以看出，拓撲網絡共得到了ERBB2、PARP1、CDK2、EIF6、AHSA1、CAV1、AKT1、HSPB1等8個候選基因。

2.5 干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因GO富集分析

使用R軟件，根據干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因，進行GO富集分析。根據基因富集數目與顯著程度，選取排名靠前的20條GO生物過程，繪制柱狀圖。見圖5～圖7。

2.6 干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因KEGG富集分析

使用R軟件，根據干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因，進行KEGG富集分析。根據基因富集數目與顯著程度，選取排名靠前的20條KEGG通路，繪制柱狀圖。見圖8。

2.7 干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病通路與基因網絡圖繪制

將上述KEGG通路導入到cytoscape3.7.2中，根據degree值大小，顯示通路與基因的富集程度，繪制網絡圖(圖9)。可以看出hsa04066是富集基因數目最多的通路，AKT1、ERBB2、EGF是數目最多的基因。

圖4 干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因的拓撲網絡Figure 4 Topological network of GHHR formula for the treatment of type 2 diabetes

圖5干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因生物過程(BP)圖
Figure5Biological process (BP) of GHHR formula in the treatment of type 2 diabetes

圖6干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因細胞成分(CC)圖
Figure6Cellular component (CC) of GHHR formula in the treatment of type 2 diabetes

圖7干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因分子功能(MF)圖
Figure7Molecular function (MF) of GHHR formula in the treatment of type 2 diabetes

圖8干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病KEGG圖

Figure8KEGG of GHHR formula in the treatment of type 2 diabetes

圖9干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病通路與基因網絡圖

Figure9Pathway and gene network diagram of GHHR formula in the treatment of type 2 diabetes

表2 干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病通路
Table2Pathway of GHHR formula in the treatment of type 2 diabetes

IDDescriptionGeneRatiohsa04066HIF-1 signaling pathway7/38hsa00330Arginine and proline metabolism4/38hsa01522Endocrine resistance5/38hsa00982Drug metabolism-cytochrome P4504/38hsa01524Platinum drug resistance4/38hsa03320PPAR signaling pathway4/38hsa01521EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance4/38hsa04068FoxO signaling pathway5/38hsa04012ErbB signaling pathway4/38hsa00360Phenylalanine metabolism2/38hsa00061Fatty acid biosynthesis2/38

3 討論

糖尿病的演變主要分為郁、熱、虛、損4個階段[12]，干姜黃芩黃連人參湯針對的就是這幾個階段[13]。因糖尿病的核心病機為中滿內熱、脾虛胃熱，故選用苦寒清胃熱之黃連黃芩，并配以干姜護中，人參益氣，諸藥相合貫穿治療糖尿病全程。雖然此方在臨床上運用較多，但對其治療2型糖尿病具體的機理和分子靶點研究現仍然較缺乏，因此本研究基于網絡藥理學聯合GEO數據分析，尋找藥物相關靶點與作用通路，探討其治療2型糖尿病的分子靶點及機理，以期進一步促進臨床運用與相關機制研究。

干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病的分子靶點網絡由49個化合物和55個化合物靶點組成。結果表明(圖3)，大多數化合物作用于多個靶點，如槲皮素、黃芩素和山奈酚分別對32、11、10個靶點起作用，因此它們很可能是干姜黃芩黃連人參湯的多效活性化合物。槲皮素、黃芩素和山奈酚同屬黃酮類化合物，前槲皮素具有降血糖、降血脂、抗炎、抑制腫瘤等多種作用[14]，對鏈脲佐菌素糖尿病大鼠降糖作用顯著[15]；黃芩素具有較強的抗氧化作用，與氧化應激關系密切[8]，能夠大量降低糖尿病大鼠中的氧自由基，從而改善胰島功能[16]；山奈酚具有抑制線粒體凋亡途徑作用，從而減輕氧化應激對胰島的損害，從而改善血糖水平[9]。在本研究中，槲皮素、黃芩素和山奈酚調節大多數2型糖尿病的靶點。黃芩黃連是本方的主要用藥，針對2型糖尿病的核心病機，與該網絡結果相符。此外，上述3種藥物成分均具有相對較高的口服生物利用度，因此，它們可能被認定為治療2型糖尿病的代表性化合物。

在對干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病的55個靶點進行相關蛋白互作網絡構建中，為了獲得更加準確的結果，對DC和BC在內的2個參數進行設置并構建新的網絡，并且根據KEGG通路，結合degree值大小，尋找與通路相關的重要基因ERBB2、AKT1、EGF(圖7)，確定了以ERBB2、AKT1、PARP1、CDK2、EIF6、AHSA1、CAV1、HSPB1等為主要基因的拓撲網絡(圖4)。兩者相結合，得到主要的候選基因為ERBB2、AKT1。

表皮生長因子受體2(ERBB2),是ROCKs和ERK1/2介導糖尿病誘導的血管功能障礙的上游效應物。改變涉及ErbB2途徑的信號轉導途徑的作用的潛在策略，已被證明對治療糖尿病引起的血管并發癥是有益的[17]。ERBB2存在于 NRG-1/Erb B2中，通過激活該通路能對糖尿病患者減輕其心肌的損傷[18]。EGFR / ERBB2信號傳導是重要的心臟生存途徑，其激活(特別是在糖尿病，局部缺血或用抑制這種級聯的藥物治療后)可以顯著改善心臟功能[19]。此外，一項4 420人的隊列研究表明，ErbB2水平升高與糖尿病的發病率增加有關[20]。

AKT1是一種蛋白激酶，其激活能促進肝細胞GK mrRNA表達，降低血糖[21]。急性胰腺炎發展過程中，AKT1在控制腺泡細胞增殖和腺泡至導管化生(ADM)形成中的關鍵作用[22]。AKT1是將胰島素信號轉導至線粒體并調節線粒體復合體V活性的主要同工型。 線粒體AKT1的激活增強了心肌細胞中的ATP產生并增加了磷酸肌酸。 該信號通路的失調可能損害糖尿病心肌的線粒體生物能[23]。

此外，本文還研究了干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病基因的GO(BP、CC、MF)和KEGG富集分析。通過生物過程(圖5)、細胞成分(圖6)、分子功能(圖7)、通路(圖8)結合富集程度顯著性與數量，篩選出了以response to steroid hormone為主的BP、Steroid hormone receptor activity為主的MF、Cyclin-dependent protein kinase holoenzyme complex為主的CC和以HIF-1 為主的信號通路。

Response to steroid hormones是對類固醇激素反應的生物過程，類固醇激素分為腎上腺皮質激素和性激素兩大類。超生理劑量的類固醇激素，拮抗胰島素的降糖作用，干擾細胞內胰島素的信號傳導，減少細胞對葡萄糖的攝取和利用。且協同其他內源性具有升糖作用的激素，增加腎上腺素受體的表達，抑制腎小管對葡萄糖的重吸收，糖代謝出現紊亂，從而出現胰島 β細胞功能障礙和胰島素抵抗(insulin resistance，IR)[24]。美國的全國健康與營養調查中，對1 461例年齡為≥20歲的男性資料進行分析，得出低睪丸激素和高雌二醇可能通過與成年男性的整體和中樞性肥胖相互作用而增加IR和2型糖尿病的風險[25]。雌激素綜合征中的雌二醇濃度可能會干擾胰島素與其受體的結合，從而產生明顯的胰島素耐藥性[26]。

Steroid hormone receptor activity是指類固醇激素受體活性，而糖皮質激素受體是類固醇激素受體的一種，研究顯示肝內糖皮質激素受體的激活和11beta-HSD1表達可能有助于db/db小鼠發生2型糖尿病[27]。胰腺β細胞中糖皮質激素信號的長期增強導致高血糖癥和葡萄糖耐量受損。此作用可能涉及通過alpha(2)-AR參與胰島素分泌調節的信號通路[28]。

Cyclin-dependent protein kinase holoenzyme complex(細胞周期蛋白依賴性激酶全酶復合物)、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)是一組結構相似且相對分子質量為34 000～40 000的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,大多數 CDK在細胞中,與細胞周期蛋白結合，形成活性激酶復合物，參與調節細胞周期、調控 DNA 轉錄、信使RNA 加工以及神經細胞的分化[29]抑制CDK5過度激活，可減輕神經元凋亡和認知缺陷，并有助于緩解糖尿病性腦神經毒性[30]。CDK2是將原發性β細胞功能障礙與糖尿病患者進行性β細胞質量惡化聯系起來的重要紐帶。而胰島β細胞的衰竭是2型糖尿病主要病因[31]。

綜上所述，本研究表明干姜黃芩黃連人參湯治療2型糖尿病最主要的活性成分為為槲皮素、黃芩素和山奈酚。這些活性成分通過與ERBB2、AKT1、EGF、 PARP1、CDK2、EIF6、AHSA1、CAV1和HSPB1等基因相互作用，通過esponse to steroid hormone生物過程、cyclin-dependent protein kinase holoenzyme complex細胞成分，steroid hormone receptor activity分子功能等作用，單獨或者共同調節HIF-1 signaling pathway等通路，從而對2型糖尿病發揮重要治療作用。