神經(jīng)血管單元體外模型在川陳皮素抗阿爾茨海默病作用中的應(yīng)用

趙宇紅，陳世堅(jiān)，文嬡雯，鄭凌云，李坤平

(廣東藥科大學(xué)1.藥學(xué)院； 2.生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006)

阿爾茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD)是以進(jìn)行性認(rèn)知和記憶減退為特征的老年性神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性病變，隨著世界人口的老齡化及AD發(fā)病率的不斷上升，國(guó)外各大醫(yī)藥公司均展開(kāi)了抗AD藥物的研發(fā)[1]。目前研究認(rèn)為，Aβ毒性損傷是AD發(fā)生的關(guān)鍵因素，但以Aβ為靶點(diǎn)的藥物開(kāi)發(fā)卻屢屢受挫，使得對(duì)抗AD有效成分發(fā)現(xiàn)的源頭，即藥物篩選模型不得不進(jìn)行重新審視[2]。在Aβ誘導(dǎo)損傷的擬AD細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn),受試成分在不同細(xì)胞篩選模型中表現(xiàn)出差異性,神經(jīng)血管單元 (neurovascular unit,NVU)是腦功能的基本單位,它在體外研究中的作用正逐步得到的認(rèn)識(shí)，本研究擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，比較NOB在體外NVU模型和單純神經(jīng)元培養(yǎng)中對(duì)Aβ毒性損傷的保護(hù)效應(yīng)，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)雄性昆明小鼠，體質(zhì)量25～35 g，用于動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，新生3 d SD大鼠，用于細(xì)胞培養(yǎng)模型，所有動(dòng)物均購(gòu)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK(粵)2013-0002。

1.2 主要儀器與試劑

胰酶、膠原酶、阿糖胞苷、谷胺酰(美國(guó)Sigma公司)；血清、B27、DMEM/F12、 Neurobasal神經(jīng)元培養(yǎng)基、青鏈霉素、慶大霉素(Gibco公司)；Nobiletin(上海江萊生物科技有限公司)；Forma 370型細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司) ；SW-CJ-1FD超凈臺(tái)、DL-4000B冷凍離心機(jī)(蘇州江東精密儀器有限公司)；680型酶標(biāo)儀(Bio-RAD，美國(guó))；SA301立體定位儀(SANS，江蘇)； MILLICELL-ERS細(xì)胞電阻儀(Millipore， Billerica，美國(guó))。

1.3 體外實(shí)驗(yàn)

1.3.1 分組及處理 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為模型組、空白對(duì)照組、20、40 μmol/L NOB處理組、NOB對(duì)照組共5組，NOB處理組先給予不同濃度NOB預(yù)孵育4 h后，在小室內(nèi)給予5 μmol/L 經(jīng)37 ℃ 孵育120 h的凝聚態(tài)Aβ1-42處理24 h；空白對(duì)照組給予生理鹽水；NOB對(duì)照組給予40 μmol/L的NOB處理。

1.3.2 腦皮層神經(jīng)元培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[3]。取新生3 d大鼠，分離大腦皮層并剪碎，0.25%胰酶胰酶消化15 min后,含血清培養(yǎng)液(10% FBS DMEM/F12)終止消化后吹散，沉淀細(xì)胞團(tuán)吸出繼續(xù)同前法消化到完全。 70 μm濾網(wǎng)過(guò)濾，800 r/min離心5 min，含培養(yǎng)液重懸并接種，神經(jīng)元貼壁后更換含雙抗的神經(jīng)元培養(yǎng)基( neurobasal-A medium、B27)。培養(yǎng)48 h后換含血清培養(yǎng)基，每3天半量換液。

1.3.3 體外 NVU 聯(lián)合培養(yǎng)

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[4]，同前法分離兩側(cè)大腦皮層并剪碎，胰酶37 ℃消化 15 min后終止消化后吹散，順序用70 μm及100 μm濾網(wǎng)過(guò)濾，濾液在冷凍離心機(jī)上800 r/min 離心5 min，棄上清，用加雙抗(青霉素100.0 U/mL，鏈霉素100.0 mg/mL)的含血清培養(yǎng)液重懸、吹散、接種， 37 ℃，5%(φ) CO2條件下培養(yǎng)，第 2天換液。第 4天多次震蕩，將粘在瓶底的上層細(xì)胞去除。BMECs 細(xì)胞的分離培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[5]報(bào)道并改進(jìn)，上法得到的100 μm濾網(wǎng)上的細(xì)胞殘?jiān)脽o(wú)血清培養(yǎng)液重懸，冷凍離心機(jī)800 r/min 離心5 min，0.1%Ⅱ型膠原酶同前法消化7 min后終止消化。將冷凍離心機(jī)800 r/min 離心5 min，用高糖DMEM(20% FBS、50 μg/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、120 U/mL肝素、2 mmol/LL-谷酰胺、100 U慶大霉素 ) 重懸細(xì)胞。同前法接種培養(yǎng)。

參照文獻(xiàn)[6]，第1天在插板外表面按5×105/mL接種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，待細(xì)胞融合70% 后反轉(zhuǎn)細(xì)胞插板，在內(nèi)表面接種 BMECs，待2種細(xì)胞完全融合后置于預(yù)先接種有皮層神經(jīng)元的 12孔培養(yǎng)板上，共培養(yǎng)3 d左右。

細(xì)胞電阻儀測(cè)定跨膜電阻值(transendothelial electrical resistance，TEER)值，均在 120～130 Ohm×cm2之間，加入培養(yǎng)液，使培養(yǎng)板液面高于小室內(nèi)液面0.5 cm，培養(yǎng)箱中觀察4 h，看液面差無(wú)變化即可開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。TEER=單層細(xì)胞電阻(Ohm)×膜面積(cm2)。

1.3.4 MTT測(cè)定細(xì)胞存活情況 實(shí)驗(yàn)完成后，加入MTT使終質(zhì)量濃度為0.5 g/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入150 μL DMSO，結(jié)晶充分溶解后，在酶標(biāo)儀上波長(zhǎng)570/630處測(cè)定，細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組(A570-A630)/對(duì)照組(A570-A630)。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.4.1 分組及處理 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)組、高、低劑量藥物組共4組，每組15只，模型組給予凝聚態(tài)Aβ側(cè)腦室注射，假手術(shù)組注射同樣體積的生理鹽水，藥物組分別予NOB 25 mg/kg及50 mg/kg腹腔注射，每日1次共10 d，給藥第3天側(cè)腦室注射造模，于造模第7天進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。模型組及假手術(shù)組給予生理鹽水腹腔注射。

1.4.2 小鼠Aβ1-42側(cè)腦室注射 用5%(φ)水合氯醛腹腔注射(0.1 mL/10 g)麻醉小鼠后固定于立體定位儀上，參照鼠腦立體定位圖譜(第5版,George Paxinos,Keith B J Franklin)[7]，在前囟后0.3 mm，矢狀縫側(cè)1 mm位置顱骨開(kāi)孔，用微量進(jìn)樣器刺入深度2.5 mm，回抽有腦脊液后注入5 μL凝聚態(tài)Aβ1-42(410 pmol)，留針1 min后取出，對(duì)照組小鼠給予等體積的生理鹽水。

1.4.3 新物體辨別實(shí)驗(yàn)[8]實(shí)驗(yàn)在50 cm×50 cm×25 cm方箱中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)分為3次，第1次將小鼠放入方箱自由活動(dòng)5 min熟悉環(huán)境后取出；5 min后將小鼠第2次面壁放入，此時(shí)箱內(nèi)置有2個(gè)大小相同的(6 cm×6 cm×3 cm)異色塑料方塊，距箱壁一側(cè) 8 cm 處直線等距排放，記錄5 min內(nèi)探索兩物體的時(shí)間(TF1，TF2)；10 min后同前法將小鼠第3次放入進(jìn)行測(cè)試，用稍大的不同色塑料方塊替換一個(gè)舊方塊，另一舊方塊移到新方塊的鏡像位置，記錄5 min內(nèi)探索新舊物體的時(shí)間(TN，TF)。判定標(biāo)準(zhǔn)：小鼠鼻在1 cm內(nèi)指向或觸及物體則記錄為探索行為。分辨指數(shù)=(TN-TF)/(TF+TN)×100%。

1.4.4 避暗實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[9]方法，小鼠置于自制隔成明暗2個(gè)等大小(15 cm×10 cm×10 cm)方箱內(nèi)，兩室有門(mén)相通，底部鋪金屬板，與可開(kāi)關(guān)的電源相連(30 V)；小鼠背向門(mén)放入明室，適應(yīng)環(huán)境3 min，開(kāi)始訓(xùn)練，小鼠進(jìn)入暗室即通電，訓(xùn)練5 min，48 h后測(cè)定3 min內(nèi)進(jìn)入暗室的潛伏期和內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中時(shí)間指標(biāo)用其倒數(shù)的對(duì)數(shù)進(jìn)行比較，采用方差分析進(jìn)行組內(nèi)比較，組間兩兩比較采用 LSD-t，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NOB對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)單一培養(yǎng)神經(jīng)元損傷的影響

NOB對(duì)照組皮層神經(jīng)細(xì)胞的存活率為102.2%，與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示NOB無(wú)細(xì)胞毒性；與空白對(duì)照組比較，模型組神經(jīng)細(xì)胞存活率為65.52%，表明Aβ1-42可誘導(dǎo)細(xì)胞損傷(P<0.01)；20、40 μmol/L NOB處理組皮層神經(jīng)細(xì)胞存活率分別為67.46%和72.16%，與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1，提示NOB處理不能改善Aβ1-42可誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。

2.2 NOB對(duì)NVU模型中Aβ1-42誘導(dǎo)損傷神經(jīng)元的影響

在NVU體外聯(lián)合培養(yǎng)模型中，NOB對(duì)照組皮層神經(jīng)細(xì)胞的存活率為105.8%，與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與空白對(duì)照組相比，模型組神經(jīng)細(xì)胞存活率為62.64%，表明Aβ1-42可誘導(dǎo)細(xì)胞損傷(P<0.01)；20、40 μmol/L NOB處理組皮層神經(jīng)細(xì)胞存活率分別為79.68%和90.83%，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

12080400存活率/%12345****####

1.空白對(duì)照組; 2.模型組; 3. 20 μmol/L NOB處理組;

4. 40 μmol/L NOB處理組; 5. NOB對(duì)照組(下圖同)。

與模型組比較：**P<0.01；與空白對(duì)照組比較：##P<0.01。

圖1NOB對(duì)單一培養(yǎng)神經(jīng)元Aβ1-42損傷的神經(jīng)元存活率的影響

Figure1Effect of NOB on the survival rate of single cultured neurons damaged by Aβ1-42(n=12)

****##*#*12080400存活率/%12345

與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01；與空白對(duì)照組比較：#P<0.05，##P<0.01。

圖2NOB對(duì)NVU聯(lián)合培養(yǎng)中Aβ1-42損傷的神經(jīng)元存活率的影響

Figure2Effect of NOB on the survival rate of neurons injured by Aβ1-42in NVU co-culture(n=12)

2.3 NOB對(duì)Aβ1-42小側(cè)腦定注射模型小鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠的回避潛伏期明顯減少(P<0.05)，錯(cuò)誤次數(shù)增加(P<0.05)，提示模型小鼠記憶下降。與模型組相比，25、50 mg/kg NOB可使回避潛伏期明顯增加(P<0.05)，減少錯(cuò)誤次數(shù)(P<0.05)，提示NOB可改善模型小鼠的記憶能力。見(jiàn)表1。

組別劑量/(mg·kg-1)潛伏期/s錯(cuò)誤次數(shù)/次假手術(shù)組-135.31±35.40 0.72±0.30 模型組-75.12±13.66#2.17±0.56 #NOB25121.69±29.10? 0.76±0.35? 50154.01±33.31?0.63±0.31?

與模型組比較：*P<0.05；與假手術(shù)組比較：#P<0.05。

2.4 NOB對(duì)Aβ1-42小側(cè)腦定注射模型小鼠新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)的影響

訓(xùn)練期各組小鼠對(duì)兩物體的探索時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明小鼠對(duì)兩物體無(wú)偏好，與假手術(shù)組相比，模型組對(duì)新物體的探索時(shí)間顯著縮短(P<0.05)，分辨指數(shù)下降(P<0.01)；與模型組組相比，25、50 mg/kg NOB均可提高模型小鼠對(duì)新物體的探索時(shí)間(P值均<0.05)及分辨指數(shù)(P值均<0.01)，見(jiàn)表2～表3。

表2 NOB對(duì)小鼠訓(xùn)練期探索時(shí)間的影響Table 2 Effect of NOB on exploring time of training period in mice

與模型組比較：*P<0.05；與假手術(shù)組比較：#P<0.05。

表3 NOB對(duì)小鼠測(cè)試期探索時(shí)間及對(duì)新物體分辨指數(shù)的影響Table 3 Effect of NOB on the exploration time and resolution index of new objects in the test period of

與假手術(shù)組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01。

3 討論

NOB是中藥陳皮的有效成分，為多甲氧黃酮結(jié)構(gòu)，具有多種生物活性[10]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，它可改善高血壓大鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能[11]，保護(hù)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷[12]，并改善LPS誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞的活化[13]，具有抗AD的潛能，其抗AD作用及機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

在中藥抗AD活性成分的機(jī)制研究中，常采用細(xì)胞模型，目前常用的神經(jīng)細(xì)胞模型可分為原代細(xì)胞培養(yǎng)模型、雜交系細(xì)胞培養(yǎng)模型(如小鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤與大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤融合雜交的NG108-15細(xì)胞系，畸胎瘤AD雜交細(xì)胞NT2等)、惡性細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞系(如神經(jīng)源的小鼠胚胎癌細(xì)胞株P(guān)19細(xì)胞)、及基因工程細(xì)胞株培養(yǎng)模型(如PC12、HT22細(xì)胞)，這些細(xì)胞模型多為單一細(xì)胞培養(yǎng)模型，可較深入地反映待測(cè)活性成分在某一特定抗AD機(jī)制中的作用，如畸胎瘤AD雜交細(xì)胞NT2就可以較好的呈現(xiàn)線粒體功能異常導(dǎo)致的Aβ沉積變化過(guò)程。但在AD的發(fā)生過(guò)程中，誘導(dǎo)AD發(fā)生的促進(jìn)因素常存在生理制約，表現(xiàn)出多個(gè)促發(fā)因素聯(lián)動(dòng)(包括血管供給、炎性激活、修復(fù)異常等)引起的緩慢進(jìn)程，其間常有腦內(nèi)多種細(xì)胞的參與及功能的失協(xié)調(diào)，因此，采用單一細(xì)胞模型篩出的活性成分常存在與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致的情況。

近年來(lái)對(duì)腦功能的研究[14]提出了NVU的理念，認(rèn)為NVU是腦功能的基本單位，中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的完整性取決于NVU的協(xié)調(diào)活動(dòng)，即腦內(nèi)神經(jīng)活動(dòng)與血流之間的耦合過(guò)程，NVU在多種神經(jīng)退行性疾病進(jìn)程中的變化與均與疾病的發(fā)展呈現(xiàn)一致性，它的核心構(gòu)成細(xì)胞是神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，各類(lèi)型細(xì)胞之間的相互作用，是大腦功能調(diào)節(jié)的物質(zhì)基礎(chǔ)。NVU作為一個(gè)整體在神經(jīng)退行性疾病進(jìn)展中的作用正在得到逐步的認(rèn)識(shí)[15-16]。

在NOB抗AD活性研究中，本研究發(fā)現(xiàn)，在單一皮層神經(jīng)細(xì)胞元體外培養(yǎng)體系中，NOB對(duì)Aβ誘導(dǎo)的單一皮層神經(jīng)細(xì)胞元損傷無(wú)明顯保護(hù)作用，在Aβ誘導(dǎo)損傷前給予20、40 μmol/L NOB處理，其細(xì)胞存活率分別為67.46%和72.16%，與模型組(65.52%)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但在NVU聯(lián)合細(xì)胞體外培養(yǎng)體系中，NOB對(duì)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元可以產(chǎn)生保護(hù)作用，在Aβ誘導(dǎo)損傷前給予20、40 μmol/L NOB處理，其細(xì)胞存活率分別為79.68%和90.83%，與模型組(62.64%)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Aβ1-42側(cè)腦定注射擬AD模型小鼠中，NOB可顯著提高小鼠回避潛伏期，減少錯(cuò)誤次數(shù)，提高新物體識(shí)別測(cè)試中對(duì)新物體的分辨指數(shù)，改善擬AD模型小鼠的認(rèn)知行為，與文獻(xiàn)[17]報(bào)道一致，提示以單一的神經(jīng)元培養(yǎng)作為體外模型進(jìn)行抗AD有效成分的篩選存在一定的盲區(qū)，而NVU模型可以減少盲區(qū)，與體內(nèi)神經(jīng)血管的相互作用環(huán)境更為接近，有更好的一致性。

NOB在兩種體外模型中的差異性，也同時(shí)表明其抗AD作用有多種細(xì)胞及因素參與，是多靶體機(jī)制的共同效應(yīng)，可能與其對(duì)NVU中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ的反應(yīng)調(diào)節(jié)及對(duì)Aβ誘導(dǎo)BMECs損傷保護(hù)作用有關(guān)，需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。而NVU聯(lián)合培養(yǎng)模型與活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)更為接近，可作為多靶點(diǎn)抗AD活性成分機(jī)制研究的較好載體。