不同直徑紫蘇梗含量及特征圖譜比較研究

田清清，張雪蘭，張志鵬，梁志毅，方朝纘，魏梅

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244)

紫蘇梗為唇形科植物紫蘇Perillafrutescens(L.)Britt.的干燥莖，秋季果實成熟后采割，呈方柱形，直徑0.5～1.5 cm[1]。紫蘇梗中含有多種化學成分，包括酚酸類、苯丙酸類、黃酮類、萜類、芳香族、脂肪族等[2]，其中酚酸類成分主要為迷迭香酸、咖啡酸，具有抗過敏、抗氧化、抗感染、抗菌、抗腫瘤、保肝、抗抑郁、降血壓、降血脂等藥理作用[3]。

中藥材商品規格等級是衡量藥材質量優良的標準，是影響中藥市場價格的重要因素，對質量信息的市場傳遞具有重要作用[4-5]。鄧哲等[6]統計藥材規格等級與指標成分或有效成分的關系，川芎、羌活、蒼術、茯苓、味連、天麻、太子參等商品規格等級與指標成分成正相關； 牡丹皮藥材按長度和粗細分等級，發現芍藥苷質量分數與等級呈負相關，而丹皮酚質量分數與等級呈正相關； 白芍、桔梗、遠志、大黃、西洋參等商品規格等級與指標成分不相關。僅以指標成分或有效成分劃分藥材規格等級，具有一定的局限性，中藥指紋圖譜或特征圖譜[7-9]具有穩定性、系統性的特點，可較為全面反映中藥所含化學成分的種類和數量，增加特征圖譜的研究有利于藥材規格等級的劃分。莖類藥材主要按照加工方法、是否野生、長度、直徑等與大小性狀相關指標劃分等級[10]，因此，本研究建立UPLC法同時測定不同直徑紫蘇梗中咖啡酸和迷迭香酸的質量分數及特征圖譜，并比較其差異性，為紫蘇梗規格等級的劃分和藥材質量控制提供實驗依據。

1 儀器與材料

Waters H-Class型超高效液相色譜儀(美國Waters公司)； 111B型二兩裝高速中藥粉碎機(浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司)； XP26百萬分之一天平(Mettler Toledo)； ME204E萬分之一天平(Mettler Toledo)； JJ2000B型電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)。

咖啡酸對照品(批號：110885-201703，純度99.7%，中國食品藥品檢定研究院)、迷迭香酸對照品(批號：111871-201706，純度90.5%，中國食品藥品檢定研究院)； 液相用甲醇、甲酸、乙腈為色譜級(默克股份有限公司)； 水為超純水(默克股份有限公司，Milli-Q Direct)； 其余試劑均為分析純。

10批紫蘇梗藥材(編號S1-S10)經廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為唇形科植物紫蘇Perillafrutescens(L.)Britt.的干燥莖，產地分別來自湖南、廣西、廣東等地。根據紫蘇梗莖橫切面直徑大小，每批紫蘇梗藥材都劃分為4類，以a、b、c、d分別表示直徑0.1～0.5 cm、直徑0.5～1.0 cm、直徑1.0～1.5 cm、直徑1.5～3.0 cm，10批紫蘇梗藥材根據不同直徑劃分為40份樣品，分別編號為樣品a1～a10、b1～b10、c1～c10、d1～d10。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)梯度洗脫(0～6 min，10%～18%A； 6～15 min，18%～50%A； 15～15.01 min，50%～10%A； 15.01～20 min，10%A)； 流速：0.4 mL/min； 柱溫：30 ℃，檢測波長：330 nm，進樣量：2 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取咖啡酸對照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，得到咖啡酸儲備液濃度為157.4 μg/mL，備用； 精密稱取迷迭香酸對照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，得到迷迭香酸儲備液濃度為350.8 μg/mL，備用。精密移取咖啡酸儲備液2.0 mL及迷迭香酸儲備液5.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，即得對照品母液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取紫蘇梗粉末(過三號篩)0.5 g，置150 mL具塞錐形瓶中，精密加入80%(體積分數，下同)甲醇25 mL，加熱回流提取45 min，放冷，離心，取上清液，得到第1次提取液； 藥渣繼續精密加入80%甲醇25 mL，同法操作，得到第2次提取液，合并2次上清液，加80%甲醇定容至50 mL，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系 分別精密吸取“2.2.1”項下的對照品母液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，加甲醇定容至10 mL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以對照品質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸。咖啡酸線性回歸方程為：Y=13 676X+209.3，r=1.000 0，結果表明咖啡酸質量濃度在0.31～31.48 μg/mL內與峰面積線性關系良好； 迷迭香酸線性回歸方程為：Y=7 848X+374.5，r=1.000 0，結果表明咖啡酸質量濃度在1.75～175.4 μg/mL內與峰面積線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下對照品母液，按“2.1”項下色譜條件平行進樣6次，咖啡酸與迷迭香酸總峰面積的RSD值為0.48%； 以迷迭香酸峰為參照峰，計算各特征峰相對保留時間及相對峰面積，RSD值均小于2%，結果表明該儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取同一批紫蘇梗粉末，精密稱定，平行稱定6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算供試品溶液中咖啡酸與迷迭香酸總質量分數，RSD值為0.91%； 以迷迭香酸峰為參照峰，計算各特征峰相對保留時間及相對峰面積，各色譜峰相對保留時間的RSD值小于 1%、相對峰面積的RSD值小于2%，結果表明該分析方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗 取同一批次紫蘇梗粉末，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，在0、1、2、4、6、8、12 h分別進樣測定，測得供試品溶液中咖啡酸與迷迭香酸總峰面積的RSD值為0.42%； 以迷迭香酸峰為參照峰，計算各特征峰相對保留時間及相對峰面積，實驗結果表明，12 h內各色譜峰相對保留時間的RSD值小于1%、相對峰面積的RSD值小于2%，結果表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.3.5 加樣回收率試驗 取同一批次紫蘇梗粉末(咖啡酸質量分數為0.157 mg/g，迷迭香酸質量分數為2.337 mg/g)，精密稱定，分別精密加入一定量的咖啡酸與迷迭香酸對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液9份，按“2.1”項下色譜條件分別進樣測定，計算咖啡酸與迷迭香酸加樣回收率及RSD值，結果見表1。咖啡酸平均加樣回收率為93.73%，RSD值為2.21%，迷迭香酸平均加樣回收率為93.19%，RSD值為2.69%，表明回收率良好。

表1 紫蘇梗的加樣回收率試驗結果Table 1 Results of recovery test of Perillae Caulis (n=9)

2.3.6 耐用性試驗 按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣2 μL，計算咖啡酸與迷迭香酸總質量分數，選擇Agilent SB C18-1、Agilent SB C18-2、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱，RSD值為2.97%； 選擇不同柱溫時，RSD值為0.46%； 選擇不同流速時，RSD值為0.57%，均能達到系統適用性要求。

2.4 不同直徑紫蘇梗質量分數的測定

2.4.1 不同直徑紫蘇梗質量分數的測定 分別取10批不同直徑紫蘇梗藥材(樣品a1～a10、b1～b10、c1～c10、d1～d10)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算不同直徑紫蘇梗中的咖啡酸和迷迭香酸質量分數，結果見表2。可見，a規格樣品的咖啡酸質量分數顯著高于b、c、d規格，迷迭香酸質量分數顯著高于c、d規格； b規格樣品的咖啡酸質量分數顯著高于c、d規格； c、d規格中，咖啡酸和迷迭香酸質量分數差異無統計學意義。

d/cm咖啡酸/(g·mg-1)迷迭香酸/(g·mg-1)0.1～0.50.106±0.007a1.278 ±0.356a0.5～1.00.090±0.009b0.916±0.196ab1.0～1.50.070±0.163c0.572±0.309b1.5～3.00.065±0.125c0.710±0.145b

注：同一行中相同字母表示在0.05水平上差異無統計學意義；不具或具不同字母表示在0.05水平上差異有統計學意義。

2.4.2 主成分分析(PCA) 采用Past 3.0軟件對10批不同直徑紫蘇梗的迷迭香酸、咖啡酸質量分數數據進行主成分分析，建立PCA模型，繪制的二維得分散點圖見圖1。可見，10批紫蘇梗不同直徑大小共40個樣本分為2類，由于紫蘇梗不同批次間存在一定差異性，除個別樣品b10、c10有交叉，其余樣品直徑<1.0 cm(a和b)聚為一類，直徑>1.0 cm(c和d)聚為一類。

2.5 不同直徑紫蘇梗的特征圖譜

2.5.1 不同直徑紫蘇梗特征圖譜的建立 分別取10批不同直徑紫蘇梗藥材(樣品a1～a10、b1～b10、c1～c10、d1～d10)，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，并記錄色譜圖。不同直徑紫蘇梗的樣品數據依次采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012A)進行評價，分別生成四個直徑的UPLC對照圖譜，見圖2。采用相對保留時間分別從40份紫蘇梗樣品中標定了15個共有特征峰，通過與對照品比對，確定其中2號峰為咖啡酸、7號峰為迷迭香酸，由于迷迭香酸在各批次不同直徑紫蘇梗中均有出現，分離度良好且峰面積最大，故選擇迷迭香酸為參照峰(S)。

直徑0.1～0.5cm直徑0.5～1.0cm直徑1.0～1.5cm直徑1.5～3.0cm0.040.020.00-0.02-0.04-1.0-0.50.00.51.0

圖1不同直徑紫蘇梗主成分分析(PCA)得分圖

Figure1PCA score plot of main components of Perillae Caulis with different diameters

403020100U/mVt/min1012141602468

R(a).直徑0.1～0.5 cm； R(b).直徑0.5～1.0 cm； R(c).直徑1.0～1.5 cm； R(d).直徑1.5～3.0 cm； A.混合對照品； 2.咖啡酸； 7.迷迭香酸。

圖2不同直徑紫蘇梗藥材共有對照特征圖譜

Figure2Common control UPLC Characteristic chromatograms of Perillae Caulis with different diameters

2.5.2 不同直徑紫蘇梗相似度評價 計算樣品a1～a10、b1～b10、c1～c10、d1～d10與紫蘇梗各直徑范圍對照特征圖譜的相似度，結果見表3。可見，相似度均>0.90，表明相同直徑范圍的不同批次紫蘇梗具有較高的相似度。

2.5.3 方差分析 采用SPSS 20.0軟件對40份樣本從不同直徑進行方差分析，并采用字母標記法進行顯著性分析，結果見表4。可見，特征峰2(咖啡酸)、12在0.1～1.0 cm與1.0～3.0 cm直徑范圍間差異有統計學意義； 特征峰1、3、10、11、14在0.1～1.0 cm與1.5～3.0 cm直徑范圍間差異有統計學意義； 特征峰6、7(迷迭香酸)、15在0.1～0.5 cm與1.0～3.0 cm直徑范圍間差異有統計學意義； 特征峰8在0.5～1.5 cm與1.5～3.0cm直徑范圍間差異有統計學意義； 特征峰13在0.5～1.0 cm與1.0～3.0 cm直徑范圍間差異有統計學意義； 特征峰4、5、9在各直徑范圍間差異無統計學意義。由于特征峰2(咖啡酸)、7(迷迭香酸)在15個特征峰中的占比高達11%、60%，故總峰在0.1～1.0 cm與1.0～3.0 cm直徑范圍間差異顯著。

2.5.4 不同直徑紫蘇梗特征峰比較 以不同直徑紫蘇梗特征圖譜15個特征峰數據進行分析，縱坐標為峰面積/取樣量，橫坐標為不同直徑規格，變化規律見圖3。可見，紫蘇梗特征峰1、2、3、10、11、12、14、15隨直徑的增加呈遞減趨勢； 特征峰4、8、13隨直徑的增加呈先增后減趨勢； 特征峰5隨直徑的增加而增加； 特征峰6、7隨直徑的增加呈先減后增趨勢； 特征峰9的變化與直徑的大小無明顯關系。總體來說，紫蘇梗特征峰隨直徑的增加呈遞減趨勢。

2.5.5 聚類分析(CA) 采用SPSS 20.0軟件對數據進行聚類分析，建立10批紫蘇梗不同直徑大小的聚類分析樹狀圖，結果見圖4。可見，可將不同直徑紫蘇梗共40個樣本聚為2類，由于不同批次間樣品存在一定差異，除去個別樣品(d1、b10、c10)，a與b聚為Ⅰ類，c與d聚為Ⅱ類。綜上所述，根據10批不同直徑紫蘇梗樣品特征圖譜聚類分析結果，基本可將紫蘇梗直徑0.1～1.0 cm(a和b)與直徑1.0～3.0 cm(c和d)之間區分開。

表3 不同直徑紫蘇梗藥材特征圖譜相似度計算Table 3 Similarity calculation of UPLC Characteristic chromatograms of Perillae Caulis with different diameters

表4 不同直徑紫蘇梗藥材方差分析比較結果Table 4 Comparison of variance analysis of Perillae Caulis with different diameters (峰面積/取樣量)/(mAu·min·g-1)

注：同一行中相同字母表示在0.05水平上差異無統計學意義；不具或具不同字母表示在0.05水平上差異有統計學意義。

圖3不同直徑紫蘇梗特征峰比較
Figure3Comparison of Characteristic peaks of Perillae Caulis with different diameters

Ⅱ類Ⅰ類0510152025c2c8c5d4d10c3c9c6c1b10d9c4d2d3d6c7d8d7d5a6a8a7b6b8b7a9a10b4a1b1d1a3a4a2a5c10b5b9b2b3

圖4不同直徑紫蘇梗聚類分析(CA)樹狀圖

Figure4CA dendrogram of Perillae Caulis with different diameters

3 討論

本研究分別考察了甲醇、80%甲醇、乙醇、稀乙醇、60%丙酮5種提取溶劑的提取效率，結果表明，當80%甲醇作為提取溶劑時，色譜峰分離效果好，響應值高； 同時分別考察了超聲處理和回流提取2種提取方式及不同提取時間、提取次數，結果表明，回流提取2次，每次45 min時，咖啡酸和迷迭香酸提取較為充分，可作為供試品提取方法。

2015年版《中國藥典》及《香港中藥材標準》中規定紫蘇梗直徑應為0.5～1.5 cm；上海、天津、重慶、廣西等省、市中藥飲片炮制規范中也明確規定了紫蘇梗直徑應為0.5～1.5 cm；《陜西省中藥飲片標準(第二冊)》中規定紫蘇梗直徑為0.2～1.5 cm。中藥材規格與等級的劃分并非一成不變的，隨著時代的發展而不斷完善，制定新的規格等級標準，有利于規范市場，提高藥材質量，引導優質優價，形成良性循環[4-5,11-12]。《陜西中藥志》中收載紫蘇梗以莖粗為佳，《現代中藥材商品通鑒》中記載以梗嫩為佳。紫蘇梗莖的粗細、老嫩受采收時間、生態因子等因素影響，傳統“莖粗”“梗嫩”等感官評價難以作為紫蘇梗藥材流通過程中的質量評價標準。本研究結果表明，紫蘇梗直徑0.1～1.0 cm與1.0～3.0 cm無論是指標成分質量分數還是特征圖譜間的差異均具有統計學意義，紫蘇梗直徑大小以1.0 cm為界線，基本可劃分為2種商品規格等級。因此，結合現有標準，建議以直徑大小為指標，將紫蘇梗劃分為2個等級，即直徑0.1～1.0 cm質量較優為第一等級，1.0～3.0 cm質量次之為第二等級。

本文探討了紫蘇梗外觀性狀中直徑大小與內在成分之間的關系，通過測定2個指標成分質量分數以及建立特征圖譜，發現紫蘇梗的直徑大小與咖啡酸、迷迭香酸質量分數呈負相關，猜測紫蘇的生產環境以及采收時間一定程度上影響了咖啡酸、迷迭香酸在莖中的累積。雖然研究結果表明紫蘇梗直徑較小則質量更優，但直徑小同時產量也較低，單以直徑小的紫蘇梗入藥不僅容易造成藥材資源的浪費，同時影響藥農種植的積極性，不利于產業的發展。因此關于紫蘇梗直徑大小、采收時間與藥材質量三者間的關系仍需深入研究，以期為紫蘇梗的種植采收提供理論指導。由于紫蘇梗藥材自身結構組織差異，藥效成分分布不同，有的在皮部大量積累，有的卻在木部中大量積累，因此以特征圖譜作為質量控制具有一定的科學性。本研究綜合質量分數測定結合特征圖譜，為從紫蘇梗直徑大小角度制定紫蘇梗商品規格等級的標準提供了參考。