不同基原紫蘇子及炮制品的化學成分差異性研究

馬瑞瑞，羅宇琴，楊小龍，官永河，李國衛，孫冬梅，陳向東

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244)

唇形科紫蘇屬一年生草本植物紫蘇Perillafrutescens(L.) Britt.有1個種、3個變種和7個變型，3個變種分別為白蘇Perillafrutescens(L.) Britt var typica (Makino) Makino、紫蘇Perillafrutescens(L.) Britt var acuta (Thunb.) Kudo和皺紫蘇Perillafrutescens(L.) Britt var crispa(Thunb.) Decne。本植物變異極大，我國古書上稱葉全綠的為白蘇，稱葉兩面紫色或面青背紫的為紫蘇，白蘇的花通常白色，紫蘇花常為粉紅至紫紅色，白蘇被毛通常稍密，果萼稍大，香氣亦稍遜于紫蘇[1]。2015年版《中國藥典》僅收載紫蘇子作為藥用植物來源[2]，因藥材細小，歷來混偽品較多。孫俊英[3]等對山東省市售的51批紫蘇子進行質量分析，結果顯示市售紫蘇子飲片不合格率較高，摻偽摻雜現象較嚴重。

目前，研究紫蘇子及其變種白蘇子鑒別的文獻較少，樊寶和等[4]通過紫外光譜及薄層色譜法研究紫蘇子和白蘇子成分的差異，發現紫蘇子與白蘇子成分雖有相同之處，但也有差異，不宜等同入藥。王雪利等[5]對目前市場上流通的紫蘇子及其偽品的微性狀進行真偽對比鑒別，得到在網眼大小、表面是否存在向上凸起的網脊以及是否存在腺鱗等性狀方面紫蘇子及其混偽品存在較大差異。黃亮輝等[6]采用HPLC法測定白蘇子和紫蘇子生品及其不同炮制品中迷迭香酸的含量，通過蘇子的HPLC圖中特征峰的強弱，可以區分白蘇子與紫蘇子。李燕等[7]對基于HPLC指紋圖譜的紫蘇子及其炮制品的質量進行研究，通過蘇子的HPLC圖中特征峰(峰)的缺失區分紫蘇子與其炮制品炒紫蘇子。以上研究均未考察紫蘇子及白蘇子化學成分的差異性，本文通過建立紫蘇子的UPLC特征圖譜，對紫蘇子、白蘇子及炒紫蘇子進行對比分析，為紫蘇子藥材的鑒別提供依據。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Waters H-Class型超高效液相色譜儀(沃特世公司)，Agilent SB C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；ME204E型萬分之一天平(梅特勒-托利多公司)；XP26型百萬分之一天平(梅特勒-托利多公司)；HWS-28型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；KQ-500型數控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q Direct型超純水系統(默克股份有限公司)。

1.2 材料

紫蘇子及白蘇子藥材由廣東一方制藥有限公司提供，經廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定分別為紫蘇子Perillafrutescens(L.) Britt.及白蘇子Perillafrutescens的干燥成熟果實，其中炒紫蘇子為實驗室自制，樣品信息見表1。

表1 樣品信息表Table 1 Sample information table

1.3 試藥

咖啡酸對照品(批號：110885-201703，質量分數99.7%)、迷迭香酸對照品(批號：110871-201706，質量分數90.5%)、木犀草素對照品(批號：111520-201605，質量分數99.6%)、芹菜素對照品(批號：111901-201603，質量分數99.2%)均由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件

以Agilent SB C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)為色譜柱；以乙腈為流動相A，0.1%甲酸溶液為流動相B，梯度洗脫(0～6 min，10%→18%A；6～15 min，18%→50%A)；流速為0.3 mL/min；檢測波長為330 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為2 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素及芹菜素對照品適量，加80%(體積分數，下同)甲醇溶液制成含每1 mL含咖啡酸32.6617 μg、迷迭香酸256.658 μg、木犀草素36.364 μg、芹菜素37.751 μg的混合對照品儲備液。取混合對照品儲備液1 mL，加80%甲醇定容于10 mL，得到每1 mL含咖啡酸3.266 μg、迷迭香酸25.666 μg、木犀草素3.636 μg、芹菜素3.775 μg的混合對照品溶液。置于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取紫蘇子飲片(過2號篩)適量，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱定質量，加熱回流60 min，放冷，用80%甲醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 取紫蘇子藥材按“2.3”項方法制備供試品溶液，分別取空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液，各進樣2 μL，色譜圖見圖1?？梢?該分析方法能正確檢測所指認的特征峰，陰性無干擾。

ABC0.40.20.00.40.20.00.40.20.0AU051015t/min

A.空白溶液； B.混合對照品溶液； C.紫蘇子供試品溶液；峰2.咖啡酸；峰7.迷迭香酸；峰11.木犀草素；峰12.芹菜素。

圖1紫蘇子特征圖譜專屬性考察

Figure1The specificity of characteristic chromatograms ofPerillasubplants

2.4.2 精密度試驗 取紫蘇子藥材，按“2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件重復進樣6次。以迷迭香酸峰為參照峰S，計算各特征峰與S峰的相對保留時間及相對峰面積，結果各色譜峰相對保留時間RSD值均<1%，相對峰面積的RSD值均<5%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取紫蘇子藥材，按“2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12 h進樣。以迷迭香酸峰為參照峰S，計算各特征峰與S峰的相對保留時間及相對峰面積，結果各色譜峰相對保留時間的RSD值均<1%，相對峰面積的RSD值均<5%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.4.4 重復性試驗 取同一批紫蘇子藥材，按“2.3”項方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣測定。以迷迭香酸峰為參照峰S，計算各特征峰與S峰的相對保留時間及相對峰面積，結果各色譜峰相對保留時間的RSD值均<1%，相對峰面積的RSD值均<5%，表明方法重復性較好。

2.4.5 中間精密度試驗 不同人員在不同時間，取同一批紫蘇子按“2.3”項方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項色譜條件在不同儀器分別進樣。以迷迭香酸峰為參照峰S，計算各特征峰與S峰的相對保留時間及相對峰面積，結果各色譜峰相對保留時間的RSD值均<1%，相對峰面積RSD值均<5%,表明方法中間精密度較好。

2.5 樣品測定

基于已建立的特征圖譜方法對紫蘇子不同炒制品進行測定，以迷迭香酸峰為參照峰，分別計算各色譜峰相對保留時間和相對峰面積。

3 結果與分析

3.1 樣品測定結果

對上述23批樣品的特征圖譜進行測定，以迷迭香酸峰為參照峰，分別計算各色譜峰相對峰面積，結果見表2?？梢姡翰煌咸K子及其炮制品相對峰面積的RSD值在35.15%～162.59%范圍，表明不同基原紫蘇子及其炮制品之間有明顯差異。從不同產地紫蘇子來看，河北省安國市的3批紫蘇子(Z8、Z9、Z10)與炒紫蘇子(C8、C9、C10)表現為峰4缺失，說明不同產地間的樣品也存在成分差異。

3.2 單因素方差分析

對不同基原紫蘇子及其炮制品的特征圖譜相對峰面積通過SPSS V 20.0統計軟件進行方差齊性檢驗及單因素方差分析，結果見表3。方差齊性檢驗中，峰2、峰3不滿足方差齊性的假設(P<0.05)，考慮到這兩個峰數據較小，所以剔除；單因素方差分析中，峰1、峰2、峰3、峰5、峰6、峰10、峰11及峰12在不同基原紫蘇子及其炮制品存在顯著差異(P<0.05)，推斷基于上述特征峰可實現對不同基原紫蘇子及炮制品進行有效區分。

3.3 多重比較

基于單因素方差分析結果，采用最小顯著差數法LSD進一步對不同基原紫蘇子及其炮制品進行多重比較[8]，結果見表4。

表2 23批樣品特征圖譜相對峰面積測定結果Table 2 The relative peak area of 23 lots of sample characteristic chromatograms

表3 方差齊性檢驗和單因素方差分析Table 3 Homogeneity of variance test & One-way anova

表4 多重比較結果Table 4 Results of multiple comparisons

由表4可見，不同基原紫蘇子及其炮制品間的差異具有統計學意義(P<0.05)，將多重比較相關信息整理，可以得出3組不同樣品之間存在顯著差異的特征峰，結果見表5。

表5 組間差異特征峰Table 5 The characteristic peaks of difference between groups

由表5和圖2可見，紫蘇子與炒紫蘇子的峰1、峰2、峰3及峰12，紫蘇子與白蘇子的峰3、峰5、峰6、峰11及峰12，炒紫蘇子與白蘇子的峰1、峰2、峰5、峰6及峰10之間的差異均具有統計學意義。

3.4 主成分分析

用SPSS V20.0軟件對23批樣品特征圖譜所得的11個共有峰進行主成分分析，得出相關矩陣的特征值及方差分析，結果見表6?？梢?，前3個成分的特征值分別為4.253、2.472、2.272，對于總方差的累積貢獻率達81.792%，基本保留了原樣本信息，所以確定提取的主成分數為3個。根據主成分載荷矩陣表7可知，峰8和峰13對主成分1的影響最大，峰2對主成分2的影響較大，峰3對主成分3的影響最大。以3個主成分分別作為X、Y、Z軸得23個樣品的主成分得分圖，可以將23批樣品分為3類，即Ⅰ類紫蘇子、Ⅱ類炒紫蘇子、Ⅲ類白蘇子，見圖3。主成分3在炮制后降低，可能是由于峰3對于溫度比較敏感，可以用峰3來區分紫蘇子與炒紫蘇子，與多重比較結果一致。在Ⅰ類中有3批炒紫蘇子(C4、C5、C6)，在Ⅱ類中有1批紫蘇子(Z8)，這4組樣品(C8和Z8，C4和Z4，C5和Z5，C6和Z6)分布位置靠近，推測可能是由于該4組樣品與其他樣品的組間差異較樣品炮制前后的組內差異大導致。

ZSZCZSZZSZCZSZCZSZBSZZSZBSZCZSZBSZCZSZBSZF1F2F10F3F6F12F11F1F2F12F30.030.020.010.000.150.100.050.000.150.100.050.00ABCD(F5)E(F6)F

A：紫蘇子與炒紫蘇子相對峰面積均值對比圖； B～C：紫蘇子與白蘇子相對峰面積均值對比圖； D～F：炒紫蘇子與白蘇子相對峰面積均值對比圖。

圖2不同基原紫蘇子及其炮制品相對峰面積均值對比圖

Figure2Comparison of the mean relative peak area ofPerillaseedsand their processed products

表6 特征值及方差分析Table 6 Characteristic value and analysis of variance

表7 主成分載荷矩陣Table 7 Principal component load matrix

主成分1主成分2主成分3

圖3主成分得分圖
Figure3Principal component score plot

4 結論

本研究在建立紫蘇子UPLC特征圖譜方法的基礎上，通過單因素方差分析、多重比較及主成分分析，對紫蘇子、炒紫蘇子及白蘇子的化學成分進行了比較，總結出紫蘇子炮制前后及不同基原間的成分差異規律，為紫蘇子的質量標準制定、品質評價提供了參考；建立的紫蘇子的UPLC特征圖譜方法重現性良好，樣品制備簡單，分析時間短，為紫蘇子的質量控制提供參考。