溫敏凝膠增強地塞米松納米粒跨角膜屏障滲透性的研究

夏紅雷，劉立中,，鮑玲紅，李繁，鄭康鈺，莫鎮杰，劉青，陳佛華，謝清春，班俊峰，呂竹芬

(1.寧波市鎮海區人民醫院藥劑科，浙江 寧波 315202； 2.廣東藥科大學廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東 廣州 510006)

角膜房水屏障(corneal aqueous barrier，CAB)是阻礙藥物向眼內遞送的重要生理屏障。Musaed等[1]研究阿昔洛韋混懸液與PLGA納米粒對角膜滲透性的作用發現后者的角膜透過量是前者的1.43倍；Roberto等[2]也證明氟米龍PLGA納米粒的角膜滲透量是市售制劑Isopotoflucon?的2.27倍；MO等[3]制備了基于脂質納米粒的凝膠滴眼液，與市售TobraDex?對比，所制備滴眼液的角膜透過量是市售制劑的2.56倍，由此可見，納米藥物遞送系統能顯著增加滴眼給藥后藥物角膜透過量，但針對滴眼給藥后納米粒藥物滲透性的研究國內鮮有報道。

目前，評價藥物跨角膜滲透性的方法主要有以離體家兔角膜為屏障模型考察PLGA納米粒滲透特性[4]，以細胞屏障模型研究重組蛋白滴眼液穿透眼球屏障能力[6]及以角膜穿刺術研究在體測定凝膠藥物滲透性[5]等方法，其中，在體實時檢測藥物濃度的方法可為評價遞送系統跨角膜滲透能力提供最可靠的信息。本文采用離體角膜及在體房水微透析方法，比較地塞米松納米粒溫敏凝膠、地塞米松納米粒和市售制劑(TobraDex?)的離體角膜滲透性及跨角膜進入房水中的滲透量，為進一步研究地塞米松跨CAB向眼內遞藥及開發地塞米松眼用凝膠提供實驗基礎與技術參考。

1 儀器與材料

1.1 藥品與試劑

1.2 儀器

Delsa Nano C粒度/ζ電位分析儀(美國Beckman Coulter公司)；DSC 4000差示量熱掃描儀(美國PerkinElmer公司)；Spectrum100紅外光譜儀(美國PerkinElmer公司)；BS224S及CP225D電子分析天平(德國Sartorius公司)；NS 1001L高壓均質機(意大利NiroSoavi公司)；RE 52-05旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國Dionex公司)；TK-12B透皮擴散試驗儀(上海鍇凱科技貿易有限公司)；mini G小型離心機(德國IKA公司)；ESP-32微透析注射泵(日本Eicom公司)；EFC-96微透析自動采樣系統(日本Eicom公司)；JY88IIN型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.3 動物

體質量1.8～2.2 kg日齡80～90 d健康的新西蘭兔，由廣東省醫學動物實驗中心三水基地提供，標準動物實驗證號：NO.44411600004435，SCXK(粵)證號：2014-0035。

2 方法與結果

2.1 HPLC法測定地塞米松的質量分數

2.1.1 色譜條件 Ultimate?XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(體積比40∶60)；檢測波長：240 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL(微透析樣品進樣5 μL)。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取地塞米松約10.05 mg，置于100 mL量瓶中，適量甲醇超聲溶解后，用甲醇稀釋并定容，得質量濃度0.100 5 mg/mL對照品儲備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 分別精密稱取納米粒溫敏凝膠1.00 g，置于10 mL量瓶，適量甲醇溶解，超聲 5 min 后，放至室溫，甲醇定容，轉移至離心管，10 000 r/min離心5 min，取上清液經0.22 μm濾膜濾過，即得供試品溶液；其他供試品相同操作。

2.1.4 專屬性考察 分別取地塞米松對照品、空白納米粒供試品、納米粒供試品、空白溫敏凝膠供試品、溫敏凝膠供試品、空白角膜滲透液、角膜滲透樣品、體內空白透析液、體內透析液樣品，按上述色譜條件進樣，色譜圖見圖1，結果表明分析方法具有良好的專屬性。

abcdeabcabc02468t/minACB

A-a.地塞米松對照品； A-b.空白納米粒供試品； A-c.納米粒供試品； A-d.空白溫敏凝膠供試品； A-e.溫敏凝膠供試品； B-a.地塞米松對照品； B-b.空白角膜滲透液； B-c.角膜滲透樣品； C-a.地塞米松對照品； C-b.體內空白透析液； C-c.體內透析液樣品。

圖1不同樣品中地塞米松的HPLC色譜圖

Figure1HPLC chromatograms of Dexamethasone in different samples

2.1.5 線性關系的考察 取對照品儲備溶液適量，分別用甲醇定量稀釋成質量濃度為1.005～100.5 μg/mL的系列溶液，供溫敏凝膠中藥物質量分數測定使用；用人工房水稀釋成質量濃度為0.1005～10.05 μg/mL的系列溶液，供離體角膜滲透性檢測使用；用空白灌流液定量稀釋成質量濃度為0.0502～10.05 μg/mL的系列溶液，供在體房水藥物濃度檢測使用；分別以藥物峰面積(A，mAU)對藥物質量濃度(ρ，μg/mL)進行線性回歸，得回歸方程：A=0.767 4ρ+ 0.066 8(R2=0.999 9)，A= 0.768 8ρ+ 0.066 2(R2=0.999 8)，A= 63.357ρ+ 2.9(R2=0.999 6)，表明線性關系良好。

在進行產品測試時測試軟件主要完成測試環境確認，測試資源的檢查和復位；產品供電及工作時序的控制；產品輸出信息的接收、存儲和實時顯示；產品測試項目的檢測和判讀。測試儀對產品參數進行動態檢測的過程中，能夠實時顯示系統測試狀態、測試數據和測試曲線，并直觀顯示測試的最終結果。

2.1.6 精密度試驗 分別取“2.1.5”項下3種溶劑的10.05、5.025、1.005 μg/mL 對照品溶液，同日內重復測定6次考察日內精密度；連續測定3 d考察日間精密度。結果表明日內與日間RSD值均小于2%，符合測定要求。

2.1.7 穩定性試驗 取離體角膜滲透與眼內微透析樣品，分別在0、2、4、8、16、24 h按“2.1.1”項色譜條件進樣測定質量分數并計算RSD值，結果RSD值分別為2.23%和3.51%，表明樣品在24 h內穩定性良好。

2.1.8 回收率試驗 取“2.1.5”項下對照品儲備溶液適量，分別用甲醇、人工房水和空白灌流液定量稀釋成高、中、低(10.05、5.025、1.005 μg/mL)3種質量濃度，HPLC進樣測定，計算回收率。結果顯示3種質量濃度的回收率分別在100.18%～104.10%、95.77%～100.48%和93.67%～102.01%之間，符合樣品分析測定的要求。

2.2 地塞米松納米粒溫敏凝膠的制備

地塞米松納米粒(DEX-NPS)的制備：參照文獻[7]方法，取處方量的普郎尼克F68、丙三醇與處方量的去離子水，混合溶解，即得水相；另將處方量的大豆卵磷脂、地塞米松，溶于適量無水乙醇中，60 ℃減壓旋蒸揮去乙醇，再加入處方量的注射用大豆油，即得油相；保持水相和油相溫度在65 ℃，將油相加至水相中，6 000 r/min高速分散10 min即得初乳，調節高壓均質二級閥壓力約20 000 kPa，一級閥調至60 000 kPa，高壓均質10 min，即得地塞米松質量濃度為1 mg/mL的DEX-NPS納米粒。

地塞米松納米粒溫敏凝膠的制備：采用冷凝法[8]，取DEX-NPS納米粒用去離子水適當稀釋，加入處方量的凝膠材料，攪拌潤濕后充分溶脹，pH值調至6.5～7.8，4 ℃冷藏，得到均一、澄清透明的無團塊溶液，即納米粒溫敏凝膠(地塞米松質量濃度為0.5 mg/mL，在29～34 ℃之間具有溫度響應性)。

2.3 地塞米松納米粒溫敏凝膠的評價

采用激光粒度儀、透射電鏡對納米粒溫敏凝膠粒徑、電位及形貌進行分析，結果見圖2。可見，納米粒溫敏凝膠中位粒徑為(184.03±1.60)nm，PDI為0.178±0.03，Zeta電位為-(38.52±1.50)mV；地塞米松納米粒中位粒徑為(173.57±2.95)nm，PDI為0.187±0.06，Zeta電位為-(35.88±0.62)mV；兩者相比，差異并不顯著，但納米粒溫敏凝膠D90較大，體系均一性相對于納米粒較差一些。在透射電鏡下，兩者顆粒大小基本在200 nm內，呈類球形，顆粒均一并且之間基本無黏連，與激光粒徑儀測得的粒徑大小相近。

圖2地塞米松納米粒(A)與納米粒溫敏凝膠(B)的粒徑、電位及TEM形貌圖

Figure2Particle size distributions,Zeta potential distribution and TEM micrographs of Dexamethasone nanoparticles (A) and temperature-sensitive gel (B)

2.4 離體角膜滲透性的評價

參考文獻[8]方法對離體角膜進行預處理，將處理后的離體角膜置于接受池與供給池之間，以人工淚液(STF)作為接受介質，供給池內加入等量的不同制劑。將擴散池置于(34±0.5)℃的恒溫擴散儀中，分別于不同時間點從接受池中取樣2 mL，同時補加等體積同溫度的接受介質，樣品采用HPLC法進樣測定，按公式(1)計算累積透過量(Qn)。

(1)

式中：V0為接受池中介質的體積5 mL；Cn為t時間時的藥物濃度(μg/mL)；Ci為前一個t時間點的藥物濃度(μg/mL)；V為取樣體積2 mL。

藥物的累積滲透量與時間的曲線結果見圖3。可見，地塞米松納米粒溫敏凝膠和地塞米松納米粒的8 h累積滲透量分別是市售制劑(TobraDex?)的1.15和2.09倍，差異均有統計學意義(P<0.05)，表明地塞米松納米粒具較強的滲透性，而溫敏凝膠延緩了納米粒的滲透。

bca50403020100Q/μg0123456789t/h

a.納米粒； b.納米粒溫敏凝膠； c.市售TobraDex。

圖3離體角膜累積透過量

Figure3The result of corneal cumulative permeabilityinvitro(n=6)

2.5 房水滲透性的評價

2.5.1 體外回收率測定 參考文獻[9]采用正透析法(式2，RR)和反透析法(式3，RL)測定體外回收率，浴槽溫度(34±1)℃，轉速200 r/min。正透析法中，微透析探針外液為地塞米松生理鹽水(DEX-NS)；反透析法中，微透析探針內液為DEX-NS，分別考察含不同組分的透析溶液[牛血清白蛋白(BSA)、羥丙基β環糊精(HP-β-CD)、或異丙醇(IPA)]、灌流液速度(0.2、0.5、0.8、1、2、3 μL/min)和藥物濃度(1、5、10 μg/mL)等因素對探針回收率的影響。

(2)

(3)

式中：RR為正透析回收率，RL為反透析回收率，Cperfusion、Cdialysis、Csolution分別為灌流液、透析液和外置溶液中地塞米松的質量濃度(μg/mL)。

2.5.1.1 透析液成分對回收率的影響 從圖4可見，3種成分透析回收率大小依次為NSBSA-NS>IPA-NS>HP-NS，其中，BSA-NS組和HP-NS組隨質量濃度增加，RR和RL均降低；IPA-NS組隨著IPA濃度增加，RR和RL回收率略為增加，而NS組的RR和RL基本無差異。因此，選擇NS為透析液較為合適。

NS1%-HP-NS3%-HP-NS5%-HP-NS0.5%-BSA-NS1%-BSA-NS2%-BSA-NS20%-IPA-NS35%-IPA-NS50%-IPA-NS回收率/%706050403020100RRRL

圖4灌流液成分對探針回收率的影響

2.5.1.2 灌流液流速對回收率的影響 從圖5可見，回收率均隨流速的增加而逐漸降低；在各流速下，RR與RL的值近乎一致，符合進行體內回收率試驗的條件。綜合取樣時間，為保證體內回收率在50%以上，選擇流速應不大于0.5 μL/min進行灌注。

100806040200回收率/%RRRL0.00.51.01.52.02.53.0流速/(μL?min-1)

圖5灌流液流速對回收率的影響

2.5.1.3 藥物質量濃度對回收率的影響 以流速為0.5 μL/min進行灌注，考察不同藥物質量濃度對回收率的影響，結果見圖6。可見， RR與RL基本不隨濃度變化而變化，范圍在60%～68%之間。

100806040200回收率/%RRRL0246810ρ/(μg?mL-1)

圖6灌流液中藥物質量濃度對回收率的影響

2.5.2 體內回收率的測定 微透析探針植入后，約2 h待前房房水恢復，以零凈通量法，分別以0.25、0.5、1、2、5、10、20 μg/mL地塞米松溶液進行灌注，流速設定為0.5 μL/min更換灌注液后至少平衡1 h后再取樣。每一樣品收集15 μL，HPLC法測定透析液中藥物濃度，按下式計算回收率，地塞米松體內回收率Rin-vivo為(62.06±2.23)%。

(4)

式中：Cdialysis、Cperfusion、Cm分別為透析液、灌流液和組織中的藥物質量濃度(μg/mL)。

2.5.3 房水滲透性試驗

2.5.3.1 動物處置 為預防創傷性手術后的炎癥反應，實驗前2 d給予家兔滴眼(鹽酸左氧氟沙星滴眼液，每天3次，每次2滴)。試驗時將兔子固定于兔籠內，耳緣靜脈注射20%烏拉坦(5 mL/kg)溶液進行麻醉，將線性微透析探針的滲析窗植入至眼前房室中。

2.5.3.2 房水中藥物質量濃度的測定 將灌流液換成NS，并分別在兔眼滴加地塞米松納米粒溫敏凝膠、地塞米松納米粒和市售TobraDex各0.15 mL，其他步驟相同，根據公式(5)計算房水中地塞米松的濃度；式中，Caqueous為房水中藥物的質量濃度(μg/mL)。

(5)

2.5.3.3 藥動學參數 繪制房水內藥物濃度-時間曲線，采用DAS3.0軟件計算藥動學參數，結果見圖7及表1。可見，納米粒溫敏凝膠可有效提高地塞米松的角膜滲透性，有效提高房水中藥物濃度，納米粒溫敏凝膠的Cmax、AUC0→8、MRT、T1/2和Tmax與納米粒和市售制劑組相比，差異均具有統計學意義(P<0.05)，納米粒溫敏凝膠和納米粒的Cmax分別是市售制劑的2.89和0.69倍，AUC0→8分別是3.01和0.98倍，表明納米粒溫敏凝膠可顯著提高地塞米松在眼部的生物利用度。

ρ/(μg?mL-1)6543210-10123456789t/h納米粒溫敏凝膠市售TobraDex納米粒

圖7房水中的藥物濃度-時間曲線

Figure7Drug concentration-time curves in aqueous humor (n=6)

表1 地塞米松在房水中的藥動學參數Table 1 Pharmacokinetic parameters of dexamethasone in aqueous humor

與納米粒比較：*P< 0.05；與市售TobraDex制劑比較：#P< 0.05。

3 討論

角膜房水屏障由上皮細胞、前彈力層、基質層和感覺神經等結構共同構成，在保護眼內免受外界化學物質傷害的同時，也將藥物等隔離在眼球之外，成為限制藥物向眼內遞送的第一道防線。本研究為證實納米粒載入溫敏型凝膠后藥物跨角膜屏障的能力，應用線性微透析探針實時取樣技術，通過建立離體角膜及實時在體房水微透析技術對不同制劑滲透性進行評價，并采用DAS 3.0分析房水內地塞米松藥動學參數。結果表明，納米粒可有效提高藥物的滲透性，溫敏凝膠可以延長納米粒在角膜的滯留時間，溫敏凝膠與納米粒兩者結合既增加了角膜滲透性，又減緩因淚液沖刷導致的納米粒流失，為有效提高藥物眼部生物利用度跨角膜屏障提供可能。本研究采用在體微透析技術與HPLC檢測技術聯合，可降低不同動物樣本間的個體差異，且與高靈敏度的分析檢測技術結合，達到了連續監測動態變化的目的。但實驗中對地塞米松如何透過角膜到達房水，目前的研究還不能闡述清楚，有待進一步研究。