1,5-脫水葡萄糖醇試劑盒性能驗證和參考區間的建立*

李 莎，溫冬梅，謝晉燁，王偉佳

廣東省中山市人民醫院檢驗醫學中心，廣東中山 528400

1,5-脫水葡萄糖醇(1,5-AG)又名1,5-脫水-D-山梨醇、1-脫氧葡萄糖，在19世紀被發現與純化，20世紀70年代應用于臨床中，是一個全新的指標，目前國內正處于研究階段，未正式投入臨床使用。1,5-AG的結構與葡萄糖十分類似，是葡萄糖的第1位碳原子上的羥基被氫取代后形成的還原型吡喃葡萄糖，其含量在人體多元醇糖類物質中僅次于葡萄糖[1]。1,5-AG主要從食物中獲得，少量由內源性合成，經腎小球濾過后大部分由腎小管重吸收，僅少量排出體外。在高血糖狀態下腎小管重吸收受抑制，從而引起1,5-AG的降低，是監測糖尿病患者短期血糖控制水平的又一良好指標。《中國血糖監測臨床應用指南》提出血清1,5-AG可作為輔助的血糖監測指標，用于指導糖尿病患者治療方案的調整[2]。研究發現，1,5-AG較糖化血紅蛋白(HbA1C)更能準確而迅速地反映糖尿病患者3～7 d的血糖控制情況，尤其是餐后血糖的波動，對于監測輕度糖尿病患者的血糖波動具有較大的優越性[3]。隨著研究的深入，越來越多的1,5-AG試劑盒投入臨床應用中，在驗證試劑盒各項性能后，應用于患者標本檢測前，需建立合適的參考區間。目前國內外有關此方面的研究很少，故建立1,5-AG的參考區間具有重要臨床意義，是解釋檢驗結果、分析檢驗信息的一個基本尺度和依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源 根據美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)C28-A2指引設定健康參考個體的具體條件：(1)無任何影響檢測結果的生理指征；(2)未服用藥物或進行飲食治療；(3)發育、精神正常，無心血管、肺、腎、肝、膽、胰等器質性疾病；(4)3個月內無輸血和手術史；(5)1個月內未患任何疾病；(6)婦女不在月經期、妊娠期或哺乳期；(6)無酗酒史；(7)無其他可能影響1,5-AG檢測結果的因素[3]。收集中山市人民醫院康體保健中心的250例體檢者血清，其中男125例，年齡12～49歲，平均年齡(33.7±8.7)歲；女125例，年齡13～49歲，平均年齡(34.1±8.8)歲。分離血清、血漿后做好標記，分別置于2～8、-30、-70 ℃冰箱中保存。

1.1.2儀器與試劑 德國西門子ADVIA 2400生化分析儀，北京九強生物技術股份有限公司生產的1,5-AG測定試劑盒，包括校準品、質控品、試劑。

1.2方法

1.2.1性能驗證

1.2.1.1準確度 取高、低值質控品平行測定3次后計算偏差，要求不超過±10%。

1.2.1.2精密度 批內精密度：分別取異常值、正常值血清標本各一支重復檢測20次；批間精密度：取高、低值質控品各一支，分成5份，每天測4次，連續測5 d。分別計算批內和批間的變異系數(CV)，要求不超過±10%。

1.2.1.3線性范圍 取接近廠家注明的線性范圍上限的血清標本(H)與去離子水(L)，制作1H、6H∶1L、5H∶2L、4H∶3L、3H∶4L、2H∶5L、1H∶6L、1L共8個水平，每個平行測定2次，求均值，用均值和理論值做線性曲線。要求相關關系的平方(R2)≥0.975。

1.2.1.4最大稀釋倍數 選擇分析范圍內的高水平血清標本2份，要求外觀清澈、無溶血、無黃疸、無脂血。用試劑盒配套的稀釋液做2、4、8、16、32倍稀釋，計算稀釋回收率(稀釋回收率=實測值/稀釋后預期值×100%)，要求小于±1/2CLIA′88允許變異(如果CLIA′88未規定，則按照10%的標準處理)。回收率可接受范圍是90%～110%。

1.2.1.6臨床可報告范圍 以檢測低限～分析測量范圍上限表示，其中分析測量范圍上限是已驗證的線性范圍上限×最大稀釋倍數。

1.2.1.7干擾試驗 將不同干擾物與血清標本按1∶9的比例混合，平行測定兩次后求均值，分別計算加干擾物的均值與不加干擾物只加相應體積去離子水的標本水平的相對偏差，要求不超過±10%。

1.2.2參考區間驗證 隨機檢測20例健康參考個體的1,5-AG水平。如果不超過2例的檢測值在驗證的參考區間之外，試劑盒廠家提供的95%參考區間可以接受。如果3例以上超出界限，則再選擇20例參考個體進行驗證；若少于或等于2個檢測值超出以上界限，則可接受；若還有3個超出參考限，需要重新檢查各種條件，決定是否建立自己的參考區間。

1.2.3建立參考區間 檢測不同性別各125份健康參考個體的1,5-AG水平后得出的均值和95%置信區間來表示。

1.3統計學處理 應用SPSS19.0軟件進行數據分析，根據Z值>3或者Z值<-3的標準剔除離群值后進行正態性和方差齊性檢驗，正態性檢驗采用Kolmogorov-SmirnovZ檢驗(K-S檢驗)，方差齊性檢驗采用F檢驗。若數據符合正態分布，參考區間可用均值±1.96s表示95%數據分布范圍。多組間兩兩差異比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1性能驗證

2.1.1準確度 準確度為1.27%，符合要求。

2.1.2精密度 異常值、正常值標本的批內精密度分別為1.58%、0.76%；低值、高值質控的批間精密度分別為3.37%、1.22%，均符合要求。

2.1.3線性范圍 區間為0.98～49.24 μg/mL，其R2=0.999 9，符合要求。

2.1.4最大稀釋倍數 可以達到的最大稀釋倍數為32倍。 見表1。

表1 1,5-AG試劑盒的最大稀釋倍數

2.1.5靈敏度 檢測低限為0.35 μg/mL，生物檢測限為0.56 μg/mL，功能靈敏度為1.00 μg/mL。

2.1.6臨床可報告范圍 0.35～1 594.24 μg/mL。

2.1.7參考范圍驗證 隨機測試了20份常規標本，其中有3份標本超出參考范圍，不符合標準要求，需要重新建立參考區間。

2.1.8干擾試驗 三酰甘油≤500 mg/dL、膽紅素≤50 mg/dL、血紅蛋白≤20 mg/dL、維生素C≤50 mg/dL對1,5-AG檢測結果均無明顯干擾，偏差均≤10%。見表2。

2.2參考區間

2.2.1性別和年齡差異 不同性別組中男性1,5-AG的均值為35.69 μg/mL，女性的均值為23.20 μg/mL，男女1,5-AG均值差異有統計學意義(P<0.05)，故需按性別建立參考區間。

2.2.2血清與血漿標本的差異 血清、血漿的1,5-AG均值分別為28.82 μg/mL、28.75 μg/mL，兩組數據差異無統計學意義(P=0.91)，故收集健康體檢者的血清或血漿標本都可。

2.2.3不同溫度下保存的血清結果的差異 2～8、-30、-70 ℃ 3個溫度下保存的血清1,5-AG均值分別為28.80、28.56、28.72 μg/mL，組間差異無統計學意義(P>0.05)，故得出結論在臨床應用中，若標本無法及時檢測，以上不同溫度都可保存。

表2 不同干擾物對1,5-AG結果的影響

2.2.4不同性別的參考區間 經檢驗，男性、女性的1,5-AG結果均符合正態分布，參考區間可用均值±1.96s表示95%數據分布范圍。男性的1,5-AG均值為35.99 μg/mL，其95%置信區間為34.61～37.37 μg/mL；女性的1,5-AG均值為23.73 μg/mL，其95%置信區間為22.38～25.07 μg/mL。

3 討 論

糖尿病作為一種慢性病，早預防、早診斷、早治療對于糖尿病患者的預后尤其重要。其中血糖監測是糖尿病管理中的重要組成部分，其結果有助于評估糖尿病患者糖代謝紊亂的程度，可以指導制訂和及時調整降糖方案。目前常用的監測指標包括血糖、HbA1c、糖化血清蛋白(GSP)、糖化清蛋白(GA)等，其中血糖需要空腹，另外3個指標檢測成本高而且反映周期長，其中HbA1c為2～3個月，GSP和GA為2～3周，而研究表明1,5-AG無需空腹采血而且能反映糖尿病患者1～2周的平均血糖水平，在反映餐后高血糖及血糖波動方面也具有優勢[4]。1,5-AG的代謝穩定，主要來源于食物，每日攝入與排出量均為5～10 mg，正常情況下波動較小。由于1,5-AG水平的變化不受性別、年齡、飲食、肥胖、運動、應激及服用各種藥物等的影響。在排除腎功能不全的情況下，1,5-AG可作為診斷和監測糖尿病的可靠指標[5]。KOGA等[6]發現暴發性1型糖尿病患者與2型糖尿病患者相比，1,5-AG水平明顯降低(<5.0 mg/L)，而HbA1c水平則無明顯差異，并由此提出1,5-AG可用于鑒別暴發性1型糖尿病和2型糖尿病，值得進一步研究和臨床推廣應用。

不同廠家生產的1,5-AG試劑盒質量不同，只有通過嚴格的性能驗證才能使用，北京九強生物技術股份有限公司生產的1,5-AG測定試劑盒準確度、精密度、靈敏度良好，線性范圍驗證符合要求，最大稀釋倍數為32倍，臨床可報告范圍是0.35～1 594.24 μg/mL，抗干擾能力強，各項性能均可滿足臨床應用需求。本試驗所采用的檢測方法是吡喃糖氧化酶法，該法簡便、快速、靈敏、準確，可為臨床監測糖尿病病情提供依據，適合各類實驗室常規應用。

不同標本類型(血清與血漿)、不同儲存溫度(2～8 ℃、-30 ℃、-70 ℃)的1,5-AG結果之間差異無統計學意義(P>0.05)，為今后研究1,5-AG和OGTT試驗中的空腹血糖、餐后2 h血糖、HbA1c等的相互聯系打下基礎。本試驗也存在一定的局限性，在建立1,5-AG的參考區間時入選者年齡在12～49歲，缺少50歲以上人群[7]，需進一步研究所得參考區間是否適用于50歲以上人群。

雖然試劑廠家已列出1,5-AG的參考區間，但由于種族、地域、經濟水平、飲食結構及檢測方法等不同，這些參考區間很難適用于所有實驗室，每家實驗室都應建立自己的參考區間[8]。試劑盒廠家給定的參考區間為>14 μg/mL，但本研究發現不同性別之間差異有統計學意義(P<0.05)，且男性明顯高于女性，與NOWATZKE等[9]的相關研究一致，但此差異的機制尚不明確，可能與不同性別的生理學差異有關。在建立了不同性別的1,5-AG參考區間后，未來進一步的研究方向是分析1,5-AG男女差異的機制；探討影響1,5-AG檢測結果的各因素，如受腎糖閾影響的大小；探討臨床適用人群[10]；探討早期篩查和輔助診斷2型糖尿病的最佳切點。