2019新型冠狀病毒實驗室檢測與預防研究

錢揚會 綜述，董建英 審校

北京京都兒童醫院：1.檢驗科；2.院辦，北京 102200

2019年12月湖北省武漢市發現多起肺炎病例均診斷為冠狀病毒性肺炎/肺部感染，后來發現這種新型肺炎存在人傳人現象。國家衛生健康委員會將這種被2019新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染導致的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)納入法定傳染病乙類管理，采取甲類傳染病的預防、控制措施。目前，國內外醫療機構及學者對SARS-CoV-2診療及防控進行研究，取得了較多進展。本院作為北京市首批開設24 h發熱門診，并接收患兒的兒童醫院，在疾病的診療及防控方面具有一定的經驗。本文主要介紹SARS-CoV-2的生物學特性、致病特點、實驗室檢測與預防。

1 SARS-CoV-2概述

SARS-CoV-2屬于冠狀病毒科，形態為圓形、橢圓形或輕度多形性，直徑為100～120 nm。人冠狀病毒有兩個血清型，即HcoV-229E和HcoV-OC43，是引起人呼吸道感染的重要病原體，人類20%的普通感冒由冠狀病毒引起，兒童的冠狀病毒感染發病率較低[1-2]。隨著細胞培養和分子生物學技術的迅速發展，臨床上對冠狀病毒的認識也逐步深入。

2 SARS-CoV-2的分子生物學特征

2.1SARS-CoV-2的基因組結構 近期，國內外多個研究團隊對SARS-CoV-2基因組進行研究，2020年1月22日，國家基因組科學數據中心正式發布SARS-CoV-2資源庫。該庫整合了WHO、中國疾病預防控制中心(CDC)、美國國家生物技術信息中心(NCBI)、全球流感序列數據庫(GISAID)等機構公開發布的SARS-CoV-2基因組序列數據、元信息、學術文獻、新聞動態、科普文章，通過對全基因組序列相似性比較和變異位點分析，獲取SARS-CoV-2病毒株之間、SARS-CoV-2病毒株與嚴重急性呼吸綜合征(SARS)冠狀病毒以及與類SARS冠狀病毒蝙蝠株之間的變異程度、變異區域、變異堿基的詳細信息。經數據分析，SARS-CoV-2與2003年爆發的SARS病毒基因組序列相似度為80%，與2017年2月從國內的蝙蝠中采集到的Bat SARS-like coronavirus isolate bat-SL-CoVZC45基因組序列相似性最高，相似度為88%[3]。

2.2SARS-CoV-2病原學特點 SARS-CoV-2屬于β屬的新型冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，為多形性，直徑60～140 nm[2]。體外分離培養時，SARS-CoV-2在96 h左右即可在人呼吸道上皮細胞內發現，而在Vero E6和Huh-7細胞系中分離培養需要6 d。SARS-CoV-2在進化樹上初步定位是β屬，與ZC45、ZXC21具有很高的同源性[4]。

3 SARS-CoV-2 臨床致病特點

基于目前的流行病學調查，COVID-19潛伏期為1～14 d，多為3～7 d，以發熱、乏力、干咳為主要表現，少數患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹瀉等癥狀。重癥患者多在發病1周后出現呼吸困難和(或)低氧血癥，嚴重者快速進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒，以及出血和凝血功能障礙等，值得注意的是重型、危重型患者病程中可表現為中低熱，甚至無明顯發熱。輕型患者僅表現為低熱、輕微乏力等，無肺炎表現[5]。

從目前病例情況看，多數患者預后良好，少數患者病情危重。老年人和有慢性基礎疾病者預后較差。兒童病例癥狀相對較輕。

4 SARS-CoV-2 的檢測方法

4.1標本的采集要求 (1)進行SARS-CoV-2感染標本采集的技術人員應經過生物安全培訓(培訓合格)和具備相應的實驗技能，在標本采集過程中，采樣人員需穿著個人防護裝備(PPE)。(2)病例標本的采集由所在病區經過培訓的醫護人員或在專業人員指導下完成。(3)根據實驗室檢測工作的需要，可根據患者病程或研究需求多次采樣。(4)每個病例必須采集呼吸道標本，重癥病例優先采集下呼吸道標本(如支氣管或肺泡灌洗液、肺組織活檢標本等)，可根據臨床表現與采集標本的時間間隔決定采集。

4.2標本的采集種類 (1)上呼吸道標本：口咽拭子、鼻咽拭子、鼻咽抽取物、深咳痰液。(2)下呼吸道標本：呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、肺組織活檢標本。(3)血清：應盡量采集急性期血清，建議使用真空采血管。

4.3標本的采集對象 (1)SARS-CoV-2感染疑似病例、疑似聚集性病例的患者。(2)其他需要進行SARS-CoV-2 感染診斷或鑒別診斷的患者。(3)其他需要進一步篩查檢測的環境或生物材料(如溯源分析)。

4.4采集標本的包裝 (1)標本采集后應在生物安全二級實驗室生物安全柜內分裝。(2)所有標本應放在大小適合的帶螺旋蓋、內有墊圈、耐冷凍的標本采集管里，擰緊，容器外注明標本編號、種類、姓名及采集日期。(3)將密閉后的標本放入大小合適的塑料袋內密封，每袋裝1份標本。

4.5采集標本的運輸 (1)SARS-CoV-2毒株或其他潛在感染性生物材料的運輸包裝分類屬于A類，對應的聯合國編號為UN2814，包裝符合國際民航組織文件《危險品航空安全運輸技術細則》分類包裝要求。(2)環境標本屬于B類，對應的聯合國編號為UN3373，包裝符合國際民航組織文件《危險品航空安全運輸技術細則》的分類包裝要求，通過其他交通工具運輸的可參照以上標準包裝。(3)SARS-CoV-2毒株或其他潛在感染性材料運輸應按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運輸管理規定》執行。

4.6采集標本的保存 用于病毒分離和核酸檢測的標本應盡快進行檢測，24 h內能檢測的標本可置于4 ℃保存，24 h內無法檢測的標本則應置于-70 ℃或以下保存(若無-70 ℃，則應置于-20 ℃暫存)。血清可在4 ℃存放3 d，可在-20 ℃以下長期保存。標本運送期間應避免反復凍融，并應設立專庫或專柜單獨保存標本。

4.7SARS-CoV-2實時熒光定量反轉錄PCR(RT-PCR)檢測 參照《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南(第三版)》[6]和《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南(第二版)》[7]進行檢測。實時熒光定量RT-PCR檢測所用分子檢測引物與探針如下。

4.7.1靶標一(ORF1a/b) 正向引物(F)：CCC TGT GGG TTT TAC ACT TAA；反向引物(R)：ACG ATT GTG CAT CAG CTG A；熒光探針(P)：5′-FAM-CCG TCT GCG GTA TGT GGA AAG GTT ATG G-BHQ1-3′。

4.7.2靶標二(N) 正向引物(F)：GGG GAA CTT CTC CTG CTA GAA T；反向引物(R)：CAG ACA TTT TGC TCT CAA GCT G；熒光探針(P)：5′-FAM-TTG CTG CTG CTT GAC AGA TT-TAMRA-3′。

4.8檢測結果的判讀 陰性：無Ct值或Ct值為40。Ct值小于37，可報告為陽性。Ct值為37～40，建議重復試驗，若重做結果Ct值小于40，擴增曲線有明顯起峰，該標本判斷為陽性，否則為陰性。

RT-PCR能夠在不同的樣品中測定SARS-CoV-2的基因物質。總的來說，現有的PCR方法特異度較高，但是靈敏度較低。這就意味著陰性的測試結果并不能排除患者SARS-CoV-2的感染。同時，由于缺乏實驗室質量控制而導致的實驗室樣品污染，可能導致假陽性結果的出現。PCR結果可以輔助臨床診斷評價，但是不能確診或排除疾病。

到目前為止，醫生只能進行一般的病毒測試，然后必須對基因組進行排序和翻譯。設備齊全的大型實驗室能夠做到這一點，但對于規模較小的實驗室存在一定困難。德羅斯滕是SARS病毒的共同發現者之一，他認為SARS-CoV-2 與SARS病毒關系密切，擁有SARS控制標本庫存的實驗室可以用其診斷SARS-CoV-2，從而縮短創建測試所需的時間[8]。

5 SARS-CoV-2的生物安全防護[9]

根據目前了解的SARS-CoV-2 的生物學特性、傳播特性、致病性、臨床資料等信息，考慮到SARS-CoV-2具有感染聚集性發病且有重癥病例和死亡病例的特點，實驗室檢測應按照病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物對SARS-CoV-2 進行管理。

5.1病毒的培養 指病毒的分離、培養、滴定、中和實驗、活病毒及其蛋白的純化、病毒凍干以及產生活病毒的重組實驗等操作，利用活病毒或其感染細胞(或細胞提取物)，不經滅活進行的生化分析、血清學檢測、免疫學檢測等操作視為病原培養。上述操作應在生物安全三級(BSL-3)實驗室中進行。使用病毒培養物提取核酸，裂解劑或滅活劑的加入必須在與病毒培養等同條件的實驗室或防護條件下進行。滅活后的病毒培養物可在BSL-2或 BSL-1實驗室操作。

5.2動物感染實驗 指以活病毒感染動物的實驗，應在BSL-3實驗室中進行操作。

5.3未經培養的感染性材料的操作 未經培養的感染性材料在采用可靠的方法滅活前進行病毒抗原檢測、血清學檢測、核酸檢測、生物化學分析等操作，應在BSL-2實驗室操作，但個人防護應參照BSL-3實驗室的防護要求。

5.4滅活材料的操作 感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后可在BSL-1實驗室操作。

5.5無感染性材料的操作 指針對確認無感染性材料的各種操作，包括但不限于無感染性的病毒DNA的操作，可在BSL-1實驗室操作。

6 SARS-CoV-2感染期間實驗室防控[9]

6.1人員的個人防護 (1)工作人員嚴格按照清潔區、緩沖區、污染區的人流走向進入實驗室。(2)進入實驗室前須穿戴好個人防護用品，至少應佩戴帽子、口罩、手套，穿著工作服、工作褲和工作鞋。(3)所有標本均應視為具有潛在傳染性，須采取標準預防措施。(4)進入發熱門診或患者留觀室、病區時穿戴防護用品程序見圖1。(5)離開發熱門診或留觀室、病區前脫防護用品程序見圖2。

圖1 人員穿戴防護用品及進入污染區程序圖

圖2 人員離開污染區及脫防護用品程序圖

6.2實驗操作的防護 (1)呼吸道來源標本的操作：呼吸道來源標本應留取至密閉容器，用密閉轉運容器進行送檢，標本核收后應立即轉入二級生物安全柜，操作過程小心謹慎，防溢、灑、滲、漏，一旦發生溢、灑后按照消毒程序進行處置。(2)其他來源標本：在尚未明確非呼吸道來源標本是否具有傳染性的情況下，應將所有類型標本視為具有潛在危險性。(3)微量采血做到一人一針一管一消，對每位患者采血前后均應洗手和(或)手消。(4)離心標本應在安全柜中打開，離心機應蓋嚴蓋子，標本離心后應靜置5 min以上方可打開離心機蓋，如發生標本管破裂、溢、灑，應立即關閉離心機蓋，按照消毒程序進行處置。(5)流感病毒檢測的咽拭子標本被接收后，應在安全柜中檢測，檢測完畢置于醫療廢物盒中，并蓋嚴蓋子。(6)在現有實驗室條件下嚴禁進行SARS病毒毒株的分離鑒定和保存。

6.3實驗室的清潔與消毒

6.3.1空氣清潔消毒 首選自然通風，保證室內外空氣的流通。室內無人時使用紫外線燈照射消毒，每次照射不小于0.5 h，每天2～3次。

6.3.2物體表面、地面的清潔和消毒 實驗室所有的物體表面、地面都應當進行清潔，受到病原微生物污染時，應當先清潔，再進行消毒。

實驗室每天應使用500～1 000 mg/L的含氯消毒劑擦拭臺面、地面和物體表面，每天至少2次，遇污染時隨時消毒。

現階段可定時用1 000 mg/L健之素溶液擦拭臺面、地面、垃圾容器盒表面等。

6.3.3標本滲、漏、溢、灑的消毒 發生標本溢、灑、滲、漏后應立即用紙巾或抹布覆蓋，用75%的乙醇溶液或1 500～2 500 mg/L的有效氯溶液由外向內傾倒，作用30 min以上，用鑷子移去紙巾或抹布，用消毒液擦拭后再用清水擦拭。溢灑處應設置明顯標識，防止其他人員靠近。

6.3.4手部的清潔與消毒 流動水洗手，方法為非手觸式開關，方法為七步洗手法，每一步驟均為10 s，最后用清水沖凈清洗劑。手部的消毒劑采用75%的乙醇溶液或70%的異丙醇或醇的復合制劑3～5 mL，按洗手方法搓揉1～2 min。

6.3.5防護用品的清洗與消毒 非一次性使用的防護用品，放入專用轉運箱中，每周由專人送洗衣房進行清洗、消毒。防護眼鏡可以用500～1 000 mg/L的含氯消毒劑消毒，采用0.2%的過氧乙酸溶液或75%的乙醇溶液浸泡30 min，清洗干燥后備用。

6.3.6實驗器材的消毒與滅菌 非一次性使用的實驗器材應進行121 ℃、20 min的壓力蒸汽滅菌，不適用于壓力蒸汽滅菌的物品可采用化學消毒法，可用75%的乙醇溶液浸泡作用15～30 min，干燥保存。

6.4醫療廢物的處置

6.4.1醫療廢物的收集 醫療廢物應分類收集，并按照類別放置于防滲、防漏、防銳器的專用包裝物或密閉的容器內。醫療廢物專用包裝物、容器，應有明顯的中英文警示標識。

醫療廢物收集容器應符合有關部門的要求，所有廢物盛裝量不應超過容器或包裝袋的3/4。嚴禁使用有破損或已經污染的收集容器，見圖3。

圖3 醫療廢物的收集流程圖

6.4.2 醫療廢物的轉運 醫療廢物應每日由專人使用專用轉運工具，按照規定的時間、路線及時清運，就近轉送到醫院醫療廢物專門暫存場

所，定期由醫療廢物集中處置單位轉運焚燒。運送工具、暫存場所等需及時清潔，遇污染時及時用1 000 mg/L的含氯消毒劑或0.2%的過氧乙酸溶液消毒。

對外運輸的醫療廢物必須做好交接工作，并認真記錄，內容包括醫療廢物的種類、數量、交接時間、集中處置單位以及經辦人簽名。登記資料至少保存兩年。