一氧化氮檢測試劑盒的性能驗證和臨床應用評價

馮文強，易向民，關卓輝，陳碧霞

廣東省廣州市紅十字會醫院檢驗科，廣東廣州 510220

一氧化氮作為一種目前所知最強的血管內皮細胞舒張因子(EDRF)和新型生物信息遞質，除具有擴張血管、降低血壓、松弛平滑肌等活性外，還具有信號傳遞、酶活性調節、免疫調節及抗(致)氧化損傷等生物活性[1-2]。一氧化氮檢測對疾病的臨床輔助診斷、病情的跟蹤分析與判定、臨床治療療效動態跟蹤和預后評價有重要的意義。此外，檢測一氧化氮對疾病發病機制的探討及有效地指導臨床治療也具有一定的價值。外源性一氧化氮供體藥物或直接吸入一氧化氮氣體治療在心腦血管疾病(如動脈硬化、冠心病、高血壓、腦卒中)、肺動脈高壓(PH)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、陽痿(ED)等疾病中具有重要意義[3]，一氧化氮檢測可以作為這些療法療效跟蹤的輔助指標[4-5]。在本研究中，筆者采用福建福緣生物科技有限公司生產的一氧化氮檢測試劑盒進行方法學評估和臨床測試分析，以驗證該試劑盒方法學的分析性能是否良好，以及是否符合臨床使用要求。

1 資料與方法

1.1一般資料 搜集本院門診及住院患者靜脈血20例，黃色分離膠管3 600 r/min,離心8 min，2 h內完成檢測。

1.2儀器與試劑 7600-020日立全自動生化分析儀，福建福緣生物科技有限公司生產的一氧化氮檢測試劑盒。高、低水平樣品和相關定值樣品均由福建福緣生物科技有限公司提供，批號分別為NO-C-190108-01、NO-S-190108-01。

1.3方法 試驗之前按照中華人民共和國醫藥行業標準對 7600-020全自動生化分析儀進行校準，嚴格按照儀器操作說明書的規定對儀器進行維護、保養及操作。

1.3.2正確度驗證 選取定值樣品進行測定，標示值為150、100、75、50、37 μmol/L，分別編號S1～S5,重復測定3次，計算測定結果和標示值的偏差。

1.3.3線性范圍驗證 選擇高、低兩個水平的標本(理想的高水平和低水平應在測量區間的高低兩端)，按不同比例混勻上述兩種水平，而得到不同稀釋水平的標本,高水平標本(H),低水平標本(L)，重復測兩次，計算兩次結果的均值，以均值(Y)和預期值(X)進行直線回歸分析，回歸方程：Y=aX+b。根據線性回歸方程式求出每一稀釋度符合線性的理論水平，計算每一稀釋度實測值和計算理論值的差異。

1.3.4生物參考區間驗證 隨機抽取20例健康查體標本為測試對象，均為查體后排除腫瘤、心腦血管疾病、肝臟疾病、腎臟疾病、自身免疫性疾病的標本。根據實測結果來對照參考范圍，觀察該試劑的正常參考范圍是否適用。

1.4統計學處理 采用Excel 2007表格軟件進行數據統計，計算相關系數和回歸方程。

2 結 果

2.1精密度驗證結果 兩個水平的精密度測定結果顯示，低水平測定均值為43.4 μmol/L，s批內為1.6 μmol/L，CV批內為3.69%，s批間為2.1 μmol/L，CV批間為4.84%，與廠家聲明的批間、批內CV≤5%相符。高水平測量均值為95.6 μmol/L，s批內為2.7 μmol/L，CV批內為2.82%，s批間為2.4 μmol/L，CV批間為2.51%，與廠家聲明的批間、批內CV≤5%相符。

2.2正確度驗證結果 用5個水平的定值樣品進行測定，計算均值和偏倚，與廠家聲明的允許偏倚范圍(±10%)相符，見表1。

表1 正確度驗證結果

注：S1～S5為標示值編號。

2.3線性范圍驗證結果 以均值(Y)和預期值(X)進行直線回歸統計，計算得到回歸方程：Y=0.982 5X-0.941 5，斜率(a)為0.982 5,在0.97～1.03;r2為0.999，r2>0.995符合要求，見圖1。若不同水平處差異值都在廠家聲稱的允許差異百分數(差異限)內，可確認廠家聲稱的可測量范圍是可接受的。根據產品的技術要求：在5～50 μmol/L，線性絕對偏差≤5 μmol/L；在50～400 μmol/L，線性相對偏差≤10%。根據以上試驗結果可知，線性范圍內偏差小于技術要求的規定(在5～50 μmol/L，線性絕對偏差≤5 μmol/L；在50～400 μmol/L，線性相對偏差≤10%)，符合產品技術要求。 見表2。

2.4生物參考區間驗證結果 根據實測的結果來對照參考值區間(30～60 μmol/L)，觀察該試劑的(正常)參考區間是否適用。測試結果見表3，由試驗結果可知，20個臨床結果中一氧化氮測試只有1個超出范圍，符合臨床使用要求。廠家提供的參考區間可作為本實驗室的參考區間。

表2 線性范圍系列水平標本測量結果

圖1 線性回歸方程

表3 參考區間驗證結果

3 討 論

一氧化氮是左旋-精氨酸(L-精氨酸)在一氧化氮合酶(NOS)的作用下生成的，它是一種小分子自由基，具有高度的親脂性，使其具有穿透膜的特殊能力[8]，也是體內重要的效應和信使分子，對微循環的舒縮有重要的調節作用。不同類型的NOS催化合成的一氧化氮具有不用的生物學作用。一氧化氮能引起血管舒張，抑制白細胞與內皮細胞的黏附，抑制血小板聚集[9]。同時，一氧化氮也是一種毒性分子，過量的一氧化氮在身體發生炎癥及免疫反應時，對機體產生損傷作用[10-11]。

人體血清中的一氧化氮在氧及水的存在下，可生成與該一氧化氮等摩爾水平的亞硝酸鹽和硝酸鹽。而在酸性介質條件下，亞硝酸鹽和硝酸鹽又能與多巴胺和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽反應，生成紫紅色復合物，在最大吸收峰545 nm波長處讀取吸光度值變化率，即可求出此時人體血清中亞硝酸鹽和硝酸鹽的總水平[12]。試劑的良好性能是保證檢驗結果準確、可靠的前提。試劑的性能驗證是評價該檢測系統是否能夠用于臨床檢驗工作的必要程序。本研究參考CLSI系列指導文件，結合工作實際，對一氧化氮檢測試劑盒在7600-020全自動生化分析儀使用的精密度、正確度、線性范圍、生物參考區間、檢出限進行了驗證和評價。參照CLSI EP15和WS/T 420-2013文件，連續檢測5 d，每天檢測1個分析批，兩個水平，重復檢測4次，計算結果可知CV在廠家聲明范圍之內。本研究采用廠家提供的正確度驗證計劃的質控品、其他第三方供應商提供的參考材料等,選擇兩個水平的參考材料，對每個參考材料分別在3～5 個不同批次中重復測量2 次，計算均值與指定值比較，估計偏倚，驗證廠家聲明，結果與廠家聲明的偏倚相符。線性范圍是評價試劑檢測性能的重要指標之一[13]。選取接近廠家聲明的線性范圍的高值和低值標本，將高值與低值按比例配制成不同水平的混合標本用于線性范圍驗證，結果顯示r2為0.999，說明該方法在試驗所涉及的水平范圍內呈線性，與廠家提供的線性范圍相符。本研究采用20例健康者標本來驗證，結果只有1例不在區間內，符合要求。為進一步檢測該試劑盒的效能，本研究還增加了檢出限檢測，結果顯示本試劑的檢出限符合技術要求。由于不同實驗室使用的儀器型號、檢測系統不同，制訂適合本實驗室的檢測方法十分重要。由于該一氧化氮檢測試劑盒并非本實驗室儀器配套試劑，關于一氧化氮檢測的報道較少，因此需要在使用該試劑前根據本實驗室情況進行驗證[14]。本研究首次對一氧化氮檢測試劑盒在7600-020全自動生化分析儀上進行性能驗證，對本項目的開展提供了質量保證。當然，本研究只是對一氧化氮檢測試劑盒進行了一般性能驗證，在后續工作中將持續進行觀察、完善，如干擾試驗等。

綜上所述，一氧化氮檢測試劑盒在7600-020全自動生化分析儀上的主要性能與廠家聲明相符，其重復性好、正確度高、線性良好、生物參考區間可靠、靈敏度高，可用于臨床分析，為新項目的開展提供了質量保證。