HBsAg膠體金檢測試劑進貨性能驗證的探討

林惠燕，孫愛農，鄭曉蘭，方育如

廣東省中山市中心血站質管科，廣東中山 528403

乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)陽性是感染HBV的標志,是檢查乙型肝炎血清標志物的重要指標之一。HBsAg是HBV的外殼蛋白，它本身不具有傳染性，但它的出現常伴隨HBV的存在[1]。在感染HBV 2～6個月后，大部分人可在血清中測到HBsAg呈反應性(俗稱“陽性”)。HBV主要感染亞洲人群[2]，且我國人群HBV感染率相對較高。在無償獻血體檢時，首先HBsAg初篩檢測合格才能進入獻血環節，然而HBV的篩選僅限于HBsAg檢測[3]，因此HBsAg膠體金試劑(簡稱乙肝試紙條)在初篩時顯得尤為重要，它能夠在獻血前體檢中有效檢測出HBsAg陽性的獻血者，并能有效控制因HBsAg陽性導致采集的血液報廢，從而降低血液檢測成本和采供血工作人員的職業暴露風險。試劑質量的好壞將影響到HBsAg初篩結果的可靠程度，按照《血站技術操作規程2019版》[4]和CNAS-CL39[5]要求，即使試劑生產廠家提供了符合國家相關標準的說明書和質量檢測合格報告,也要建立并執行試劑的質量抽檢制度，對每次購進的試劑進行質量抽檢，驗證產品性能是否真實、有效，保證試驗結果檢測可靠。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 HBsAg酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑由英科新創(廈門)科技有限公司、珠海麗珠試劑股份有限公司提供；乙肝試紙條由英科新創(廈門)科技有限公司、北京萬泰生物藥業股份有限公司提供，定義廠家為A試劑、B試劑(不分順序)；水平為4、8、64 IU/mL的HBsAg標準物質由北京康徹思坦生物技術有限公司提供；所有試劑均在有效期內使用。

1.1.2標本來源 選取中山市中心血站2018年6月至2019年6月試驗確證為HBsAg陽性獻血者標本40份,試驗確證為陰性的健康獻血者標本10份，其中40份陽性標本獻血者年齡18～55歲、中位年齡34歲，男25例(62.5%)、女15例(37.5%)。

1.1.3陽性對照品 分離并留取經兩個廠家HBsAg的ELISA試劑檢測均陽性的獻血者血漿標本，-25 ℃以下低溫保存備用。

1.1.4陰性對照品 留取經兩個廠家HBsAg的ELISA試劑和HBV DNA檢測均陰性的獻血者血漿標本作為陰性對照，同時用來做液體移行速度檢測。

1.1.5全血標本 留取經兩廠家HBsAg的ELISA試劑和HBV DNA檢測均陰性獻血者全血標本。

1.2儀器與環境 檢測儀器使用Tecan RSP全自動加樣儀(瑞士帝肯)、ELISA全自動加樣儀(安圖生物)、BEP Ⅲ全自動免疫分析儀(德國西門子)、Tecan Sunrise日升酶標儀(瑞士帝肯)、HydroSpeed洗板機(瑞士帝肯)、iEMS孵育振蕩器(美國熱電公司)、羅氏COBAS S201核酸檢測分析儀(瑞士羅氏)、Thermo單通道移液器20～200 μL(美國賽默飛世爾)。在恒溫實驗室(室溫22～25 ℃、濕度40%～60%)完成所有試驗。

1.3方法

1.3.1乙肝試紙條的最低檢出限和最佳檢出限 廠家提供水平為4、8、64 IU/mL的HBsAg標準物質，其中1、2 IU/mL是使用4 IU/mL的HBsAg標準物質加生理鹽水倍比稀釋所配制。分別測定上述兩種不同廠家的乙肝試紙條，按時間5、10、15、30 min觀察試紙條的變化，30 min內能檢測出最低結果定義為最低檢出限，15 min內檢測出全部結果定義為最佳檢出限。

1.3.2移行速度(時間)與血球阻斷率檢測 乙肝試紙條在加樣后立即觀察，加樣后液體移行速度(陽性對照線顯色時間)應<3 min，乙肝試紙條的血球阻斷率應合格(即本底應無明顯變紅)。

1.3.3標準物質的ELISA評估 所有HBsAg標準物質均用ELISA檢測,選擇最佳S/CO值，以此為標準，從已知HBsAg陽性標本中挑選S/CO值相對應的標本。設置20份陽性標本與廠家最佳檢出限水平標準物質進行對比檢測。

1.3.4最佳檢測水平標本的乙肝試紙條檢測 選擇最佳檢測水平(S/CO值)獻血者血漿標本，用不同廠家乙肝試紙條檢測。

1.4統計學處理 采用SPSS23.0統計軟件進行數據分析,計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1HBsAg標準物質乙肝試紙條檢測情況 從檢測時間來看，2 IU/mL為HBsAg最低檢測水平，A試劑在15 min內能夠檢測出8例，最遲能在30 min內能檢測出所有陽性結果；B試劑在15 min內能夠檢測出7例，30 min內能檢測出8例。從結果上看，不同試劑之間差異不大。4 IU/mL為HBsAg最佳檢測水平，兩家試劑均在15 min內檢測出所有陽性結果。64 IU/mL為高水平標準物質，兩家試劑均在5 min內檢測出所有陽性結果，均無后帶現象導致的假陰性結果出現。結果見表1。

表1 HBsAg標準物質乙肝試紙條檢測情況[n(%)]

表2 液體移行速度(時間)與血球阻斷率

注： -為未檢測。

2.2液體移行速度(時間)與血球阻斷率 選擇5例陰性血漿和全血標本，分別用上述兩個廠家乙肝試紙條檢測，結果均合格，見表2。

2.3ELISA檢測HBsAg標準物質的最佳S/CO值選擇 結果顯示，不同水平的HBsAg標準物質，檢測出不同的S/CO值，見表3。在定性試驗中，應該用接近臨界值的標本對試紙條進行靈敏度評估。因此，根據表1結果，計算出HBsAg標準物質在最佳檢測水平4 IU/mL時ELISA試劑1、2的最佳S/CO檢測限(CV均值±1s)，分別是28.45±2.13和29.08±2.18，綜合考慮定出最佳S/CO值為28.00±2.00。

表3 ELISA檢測HBsAg標準物質的最佳S/CO值選擇

注：△表示該試劑盒檢測結果A值≥3.0，均為強陽性。

2.4獻血者HBsAg兩家ELISA陽性標本與標準物質用乙肝試紙條檢測的結果 根據ELISA的S/CO結果，選擇最佳檢出限標本、強陽性標本及4 IU/mL、64 IU/mL水平的標準物質各20份，分別使用兩家廠家乙肝試紙條檢測，結果表明，最佳檢出限標本和4 IU/mL的標準物質均能在15 min內被檢出，強陽性標本和64 IU/mL的標準物質均能夠在5 min內被檢出，都沒有出現后帶(假陰性)現象。

2.5開展乙肝試紙條性能驗證前后HBsAg檢測情況 開展乙肝試紙條性能驗證前，2017年無償獻血47 461例，HBsAg陽性292例，陽性率0.62%；開展乙肝試紙條性能驗證后，2018年無償獻血48 889例，HBsAg陽性241例，陽性率0.49%，2018年HBsAg陽性率有了明顯下降，差異有統計學意義(χ2=6.55，P<0.05)。

3 討 論

HBsAg膠體金檢測法(又稱金標法)檢測HBsAg具有操作簡單方便、檢測快、結果易看并且可行單份標本檢測等優點[6],且保存方便。我國現階段HBsAg膠體金檢測為血站獻血者采血前初篩的一項必要手段，因此試劑的質量好壞影響著檢測結果的可靠程度，單位質管部門在新進試劑使用前就必須做好每一批試劑的抽檢，檢測合格發放質檢合格報告；檢測不合格，與廠家協商作退換貨處理。

本次最低檢出限水平(2 IU/mL)與國內外相關研究結果(2.0～2.5 IU/mL)[7-8]相差不大,比廠家提供的合格報告的最低檢測量2.5 ng/mL(相當于5 IU/mL)更低。2004年，世界衛生組織將HBsAg標準物質的定值單位從ng/mL改成IU/mL，換算公式1 IU/mL≈0.5 ng/mL。4 IU/mL標準物質從HBsAg膠體金檢測結果上看，處于臨界水平，能較好反映試紙條的靈敏度檢測水平，在規定時間內能檢測出所有結果。

本研究對這種檢測方法使用不同廠家提供的試紙條檢測后的數據進行分析,從表1、3可以看出，兩個廠家不同水平的HBsAg標準物對比，30 min內檢測結果基本一致，在最低檢測限2 IU/mL上，只能檢測出個別結果，導致抽檢結果不合格，建議不要使用該水平的標準物質作為進貨檢驗標準。使用HBsAg最佳檢出限標本進行驗證，合格結果也能達到100.0%。由此看來，陽性標本S/CO值在28.00±2.00也能較好驗證出乙肝試紙條水平。高水平標準物質64 IU/mL和HBsAg強陽性標本，能在短時間檢測出陽性結果。

乙肝試紙條滲透速度(即液體移行速度)的快慢對檢測的結果會有影響，太快會造成假陰性，HBsAg-Ab1-Au還沒來得及與Ab2結合就超過了檢測線[9]；太慢也會導致假陰性。高水平標準物質和強陽性標本中的HBsAg水平過高,遠超過抗原抗體結合的最大適宜比例，沉淀反應也會不明顯,就會出現后帶現象[10]，即假陰性結果。因此，還要留意高水平(強陽性)質控品的結果。

開展HBsAg膠體金試劑性能驗證后，對獻血者標本進行ELISA檢測仍檢出少量的陽性標本，經分析原始數據，發現大多是弱陽性(S/CO值<20)人群。2018年采取該驗證方法進行進貨驗收后，當地獻血者HBsAg初篩后陽性率有了明顯下降，在此期間曾出現一批乙肝試紙條因檢測結果不達標而退回廠家，說明每批試劑開展進貨檢驗是有必要的。

按照進貨檢驗要求[4-5]，對于血源篩查的體外診斷試劑盒，必須要有國家食品藥品監督管理部門批簽發報告，其他檢測試劑，以生產廠商出具的出廠檢驗報告為準。當需要留取HBsAg陽性標本時，建議選擇S/CO值在28.00±2.00的陽性標本作為驗證使用，陽性標本必須經過消毒滅活后裝管冷凍保存，盡量降低檢測人員職業暴露的風險。水平為4 IU/mL的HBsAg標準物質和S/CO在28.00±2.00的HBsAg陽性標本均能夠作為乙肝試紙條進貨性能驗證使用。而使用4 IU/mL的HBsAg標準物質既沒有職業暴露風險，又解決了HBsAg陽性標本在低溫存儲環境下反復凍融導致抗原活性下降的問題，是乙肝試紙條進貨性能驗證的最佳選擇。