寧夏某醫院225例非小細胞肺癌患者EGFR基因突變檢測結果分析*

師志云，郭雅琪，江海峰，張玉英，趙 玥，趙倩穎，何學虎，梁小燕，董 潔，賈 偉△

1.寧夏醫科大學總醫院醫學實驗中心，寧夏銀川 750004；2.寧夏臨床病原微生物重點實驗室，寧夏銀川 750004；3.寧夏醫科大學總醫院病理科，寧夏銀川 750004

肺癌是全球范圍內發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，《2018年美國癌癥統計》報告中指出2018年美國將出現173.5萬例癌癥新發病例和60.9萬例癌癥死亡病例，其中肺癌發病人數為12.1萬例(14%)，死亡人數為11.2萬例(13%)[1]。《A Cancer Journal for Clinicians》公布了2015年中國有429.2萬新發腫瘤病例和281.4萬腫瘤死亡病例[2]，肺癌是癌癥死因之首。非小細胞肺癌(NSCLC)約占原發性肺癌的85%[3]，臨床上大部分患者確診時已為晚期[4]，失去了最佳手術治療時機。

隨著腫瘤分子生物學的發展，分子靶向治療藥物如小分子表皮生長因子酪氨酸酶抑制劑(EGFR-TKI)的出現[5-6]，為NSCLC患者帶來曙光。研究報道，EGFR基因突變是EGFR-TKI敏感的重要預測因子[7]。本試驗采用的擴增阻滯突變系統(ARMS)法是目前檢測 EGFR基因突變最為敏感的方法，對2014年1月至2017年12月在寧夏醫科大學總醫院就診的225例NSCLC患者進行EGFR基因突變檢測，并對其不同性別、年齡、民族、年份、季節、標本類型及病理類型進行比較分析，為判斷疾病發展過程、預后及EGFR-TKI靶向治療提供分子病理學依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2014年1月至2017年12月在寧夏醫科大學總醫院住院的首次確診或術后復發的晚期NSCLC患者225例為研究對象，其中男117例，女108例；年齡23～85歲，平均(58.9±11.0)歲；225例標本中組織石蠟切片201例，胸腔積液細胞蠟塊24例；病理類型中腺癌204例，鱗癌12例，腺鱗癌6例，大細胞癌3例。納入標準：(1)組織學或細胞學確診為NSCLC；(2)在2014年1月1日至2017年12月31日首次確診或術后復發的晚期NSCLC住院患者。排除標準：(1)沒有病理確診的NSCLC患者；(2)不符合納入標準的其他情況的患者。

1.2試劑與儀器 FFPE DNA提取試劑盒(中國廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司)、人類EGFR基因29種突變熒光PCR檢測試劑盒(中國廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司)；7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，DS-11微量核酸蛋白濃度測定儀(美國DeNovix公司)。

1.3方法

1.3.1標本采集 手術石蠟切片及細胞石蠟標本均經有經驗的病理科醫生進行質量評估，切取5～8張白片，裝于EP管內，立即進行DNA提取。

1.3.2DNA提取 嚴格按照試劑說明書進行操作。

1.3.3DNA純度及水平測定 A260/A280在1.8～2.0，DNA水平調整至2 ng/μL。

1.3.4ARMS-PCR檢測 ARMS-PCR對EGFR基因編碼區的4個外顯子29種突變位點進行檢測，所有試驗均設陰、陽性對照。

1.3.5結果判讀 嚴格按照試劑盒說明書提供的檢驗結果的解釋進行判讀。

1.4統計學處理 采用SPSS 17.0統計學軟件對所得數據進行統計學處理，計數資料以例數或百分率表示，組間比較用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1EGFR基因突變率及突變類型 225例患者中，EGFR基因共突變113例，總突變率為50.22%(113/225)。其中，最常見突變為19、21外顯子，突變亞型最多的為19-del，共48例(21.33%)，其次為21-L858R，共40例(17.78%)。EGFR基因各種突變類型突變率相比，差異有統計學意義(χ2=148.209，P<0.05)，見表1。在113例突變中，共發現10例雙位點突變，包括3例L858R和T790M雙突變，2例G719X和S768I雙突變，其余雙突變(19-del和S768I，L858R和S768I，19-del和T790M，G719X和L861Q，G719X和T790M)各1例。

表1 EGFR基因突變率及突變類型

注：EGFR基因各種突變類型突變率相比，χ2=148.209，P<0.05。

2.2EGFR基因突變與臨床特征的關系 225例患者中，男、女突變率分別為41.03%(48/117)和50.93%(55/108)，兩者相比差異無統計學意義(P>0.05)；<60歲與≥60歲、漢族與回族突變率相比差異無統計學意義(P>0.05)；2014年(63.89%)至2017年(30.19%)EGFR基因突變率有明顯下降趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)。不同季節中，春季突變率最高(53.57%)，冬季突變率最低(34.55%)，四季突變率相比差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3EGFR基因突變與病理特征的關系 225例患者中，組織石蠟切片EGFR基因突變率46.27%(93/201)，胸腔積液細胞蠟塊突變率41.67%(10/24)，兩者相比差異無統計學意義(P>0.05)。病理類型中，腺癌標本占90.67%(204/225)，EGFR基因突變率最高，占49.02%(100/204)，各種病理類型突變率相比差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表2 EGFR基因突變與臨床特征的關系

表3 EGFR基因突變與病理特征的關系

注：4種病理類型突變率相比，χ2=13.578，P<0.05。

3 討 論

近年來，隨著分子信號傳導通路在NSCLC發生、發展機制中研究的深入，相應靶向藥物的驅動基因包括EGFR基因、間變性大細胞淋巴瘤激酶(ALK) 融合基因、酪胺酸蛋白激酶(ROS1)基因重排逐漸成為熱點，使NSCLC的治療進入分子靶向治療時代，且逐步實現個體化治療。

EGFR是一種跨細胞膜糖蛋白受體，具有酪氨酸激酶活性，是原癌基因，其突變及過表達與腫瘤細胞的增殖、活動性、粘連性、侵襲性、凋亡抑制和血管生成相關[8]。2017年美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)指南[9]中建議對中晚期NSCLC患者進行EGFR基因常規檢測，對于敏感突變患者推薦靶向藥物作為一線治療藥物。目前EGFR-TKI已通過美國食品藥品監督管理局(FDA)批準的藥物有一代吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)等，二代阿法替尼(afatinib)和三代奧西替尼(osimertinib)等[10]。

既往研究表明，NSCLC患者的EGFR基因突變率在不同國家、地區存在一定差異，亞洲人種EGFR基因突變率(51.4%)高于北美或歐洲(10%左右)，且以女性、非吸煙、腺癌患者為主，達70%～80%[11-12]。本研究225例患者均采用ARMS-PCR進行EGFR基因突變檢測，EGFR基因總突變率達50.22%(113/225)，其中包括男性患者發生突變48例，突變率41.03%(48/117)；女性患者發生突變55例，突變率50.93%(55/108)，二者差異無統計學意義(P>0.05)，考慮可能與樣本量不大有關。<60歲突變率39.25%(42/107)與≥60歲突變率51.69%(61/118)相比，漢族突變率45.03%(86/191)與回族突變率50.00%(17/34)相比，差異均無統計學意義(P>0.05)；春季(3-5月)突變率最高(53.57%)，冬季(12-2月)突變率最低(34.55%)，差異無統計學意義(P>0.05)；2014-2017年EGFR基因突變率有明顯下降趨勢，從63.89%下降到30.19%，差異有統計學意義(P<0.05)。

董強剛等[13]將176例NSCLC患者行EGFR基因檢測，其中腺癌組患者中EGFR基因突變率為44.8%(30/67)，腺鱗癌組患者EGFR基因突變率為33.3%(10/30)，鱗癌組患者突變率為20.3%(13/64)，差異有統計學意義(P<0.05)。EGFR基因突變在腺癌(或腺鱗癌)中突變率更高。本研究中，腺癌204例，突變100例，突變率49.02%；腺鱗癌6例，突變2例，突變率33.33%；鱗癌12例，突變1例，突變率8.33%，3種病理類型突變率差異有統計學意義(P<0.05)。本研究EGFR基因突變在腺癌的NSCLC中更為常見，腺癌、腺鱗癌EGFR突變率與國內其他報道相符[13-14]。

既往研究報道，EGFR基因不同突變位點的生物學功能各有不同，外顯子18、19及21發生突變的NSCLC對EGFR-TKI具有良好療效，外顯子20中T790M突變是形成EGFR-TKI繼發性耐藥的重要機制之一[15]，且最常見突變為19號外顯子的缺失突變19-del和21號外顯子的L858R點突變[16]。WEI等[17]分析廣西NSCLC患者EGFR基因突變率為35.7%(537/1 506)，且最常見的突變亞型為19-del(293/1 506，19.5%)和L858R(227/1 506，15.1%)，并分析這兩個突變位點在性別、吸煙情況、病理類型方面差異無統計學意義(P>0.05)。在HSIEH等[18]的研究中，21號外顯子突變所占比例更大(13/17，76.47%)。本研究中， 19-del缺失突變率為21.33%(48/225)，L858R點突變率為17.78%(40/225)，20外顯子T790M耐藥突變率為3.56%(8/225)，20外顯子20-Ins插入突變(非敏感突變)突變率為1.33%(3/225)，同時發現10例EGFR基因雙位點突變。EGFR基因總突變率與文獻報道一致，只是突變類型比例稍有不同，考慮與樣本量及人群選擇有關。

因此，NSCLC患者中EGFR基因存在較高的突變率，其基因突變分型有助于篩選出適合EGFR-TKI腫瘤靶向治療的人群，指導臨床個體化用藥及減輕患者的經濟負擔。