成年人鼻中隔軟骨的成分分析

徐海艇，胡科鵬，薛繼鑫，史吏，宋永煥，李曉陽

（1.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院整形外科，浙江溫州325027；2.溫州醫科大學仁濟學院，浙江溫州325035）

鼻整形通常需要結構材料來修復因外傷、先天性畸形或先前手術切除而造成的軟骨缺損[1]，自體的、異體的、合成的植入物和移植物都有較廣泛的應用。然而，異體材料具有免疫排斥、疾病傳播和再吸收的風險，而合成材料與感染、擠壓和異物反應的風險相關[2]。因此自體軟骨往往是首選的材料，供區多來自鼻中隔軟骨，耳甲腔和肋軟骨區。在這些材料中，自體鼻中隔軟骨因其良好的力學性能、容易獲取、供體部位發病率低而成為鼻部重建的首選材料[3]。然而，自體鼻中隔軟骨的應用受到多種限制，如可用組織數量有限、部分缺損重建幾何結構不佳。這些限制促使研究人員探索尋找軟骨自體移植物的替代重建材料。組織工程所需的自體鼻中隔軟骨形狀和數量可以通過擴增培養軟骨細胞制作出來[4]，然后在三維培養系統中進行分化以產生功能軟骨細胞外基質（extracellularmatrix，ECM）[5]。成熟和塑形階段可產生與預期的形狀和結構特性相一致的新生軟骨[6]。然而重建鼻中隔軟骨，必須要明確鼻中隔軟骨各部位的成分。本研究將鼻中隔軟骨分為5個區域以更好地理解鼻中隔軟骨成分與不同區域的關系。

1 材料和方法

1.1 材料 7具匿名新鮮冷凍尸體的鼻中隔軟骨，2015年2月至2018年2月（解剖教研室提供）均無明顯的鼻中隔軟骨偏曲。本研究經本院倫理委員會批準。

1.2 方法 用鼻翼緣閉合切口或開放切口的方法，逐層暴露7位成年人尸體鼻部解剖層次，然后完整切取鼻中隔軟骨，清除表面軟組織，并將鼻中隔軟骨分為5個區域，分別標記為a，b，c，d，e區（見圖1）。

圖1 鼻中隔軟骨5個區域分布

1.3 生化檢測 生物化學測定用的樣品在磷酸鹽緩沖的乙二胺四乙酸（0.5mg/mL）中用蛋白酶K（proteinaseK，PK）使其消化溶解一夜，溫度為55℃。采用適用于人軟骨的PicoGreenDNA含量測定法（美國Invitrogen公司）測定細胞數量。取每個樣品消化液的一部分與PicoGreen試劑混合。在熒光分析儀上用480nm激發光波長和520nm發射波長測定熒光。在適當的緩沖溶液中，用人類DNA度量標準將熒光值轉換為DNA量。再將DNA含量標準化，以確定細胞數（7.8pgDNA/軟骨細胞）和每mg濕組織質量。

采用PK消化液和二甲基亞甲基藍（dimethylmethyleneblue，DMMB）反應測定硫酸糖胺聚糖（sulfatedglycosaminoglycans，sGAG）的含量。每個樣本取消化液的一部分與DMMB染料混合。用熒光分析測得525nm處的吸光率，并與用C型硫酸軟骨素制成的標準品（美國Sigma公司）進行比較。人軟骨中存在的sGAG主要是硫酸軟骨素，透明質酸和角蛋白硫酸酯所占比例較小[7]。因此，使用硫酸軟骨素作為標準來源進行比較是合理的。此外，用該方法測定sGAG與人軟骨的固定電荷密度高度相關。sGAG含量用每mg濕組織質量（消化前）和DNA含量進行標化。

采用羥脯氨酸法測定PK消化液中總膠原蛋白的含量[7]。在通風柜中，加入與樣品體積相等的12.1mol/L鹽酸（美國Sigma公司），在110℃下孵育16～18h。樣品從高溫中取出，讓其恢復到室溫，短暫離心，在110℃（16～24h）條件下蒸發干燥。干燥后的樣品溶解在枸櫞酸鹽緩沖液中。將部分重組樣品和羥脯氨酸標準品與氯胺T試劑反應，然后再與對二氨基苯甲醛反應，用EMAX精密微孔板讀數儀（美國Sunnyvale公司）在560nm處讀取吸光率。以羥脯氨酸衡量標準為基礎，將樣品吸光率轉換為羥脯氨酸含量。羥脯氨酸含量按每mg濕組織質量（消化前）和DNA含量進行標化。根據膠原蛋白與羥脯氨酸的質量比值（為7.1），將羥脯氨酸含量轉化為膠原蛋白含量。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS20.0軟件進行統計分析。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey-HSD法檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 每mg濕重細胞數和膠原蛋白量 濕軟骨片段5個區域每mg濕重細胞數差異無統計學意義（P＞0.05），每mg濕重的膠原蛋白含量差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 每mg濕重所含sGAG量 每mg濕重的sGAG含量各區域間差異有統計學意義（P ＜0.01）；與a區和c區比，b區和d區的sGAG含量顯著增加（P＜0.05），可知sGAG在鼻中隔軟骨并非均勻地分布于各個區域，見表1。

2.3 膠原蛋白與sGAG的比值 膠原蛋白與sGAG的比值在各區域間差異有統計學意義（P＜0.01）；與a區和c區比，b區、d區和e區膠原蛋白與sGAG的比值顯著減小（P＜0.05），見表1。

表1 鼻中隔軟骨成分5個區域的變化（每組n=7，

表1 鼻中隔軟骨成分5個區域的變化（每組n=7，

與a區比：aP ＜0.05；與c區比：bP ＜0.05

區域 每mg濕重細胞數（×103） 每mg濕重所含膠原蛋白（μg） 每mg濕重所含sGAG（μg） 膠原蛋白與sGAG的比值總量 22.9±2.9 60.3±6.4 14.6±3.5 4.14±0.8 a 23.0±2.9 60.9±6.2 13.1±1.6 4.61±0.4 b 24.1±2.5 62.5±5.9 16.5±1.3ab 3.70±0.3ab c 21.7±3.1 59.0±7.2 12.7±0.9 4.65±0.4 d 22.5±3.1 61.4±7.1 16.3±1.1ab 3.81±0.8ab e 23.4±2.6 57.7±4.7 14.5±2.4 3.92±0.2ab F 0.715 0.654 9.336 6.609 P 0.588 0.629 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

成人軟骨含有軟骨細胞和大量的ECM，按重量計算膠原蛋白是最豐富的分子成分。已經證明ECM中的膠原纖維可以加強軟骨組織的完整性、抗拉剛度、抗拉強度和抗脹性。蛋白聚糖是軟骨的另一主要分子成分，主要以聚集蛋白聚糖的形式存在。高分子聚合蛋白由一個附著許多sGAG鏈的核心蛋白質組成[8]。雖然關節軟骨的組成已被充分記錄，但以前的研究沒有量化人鼻中隔軟骨主要成分（軟骨細胞、膠原蛋白和硫酸化糖胺聚糖）的相對濕重。為了提供用于重建新的人鼻中隔軟骨基線數據，本研究使用7個成人鼻中隔軟骨標本建立這樣的信息。

NEUMAN等[9]從鼻中隔軟骨（剛好在上頜嵴之上）獲取軟骨，測定了人鼻中隔軟骨的細胞結構和主要基質成分，其研究結果顯示，每mg軟骨濕重含24900個細胞（3700～51800），77.4μg膠原蛋白（458～128.6μg），28.7μgsGAG（13.6～44.6μg），膠原蛋白與sGAG的平均比值為3.03。這與本研究中所得的數值相當。許多組織的軟骨成分因其特定位置而異，如關節軟骨組成取決于關節的位置、關節的區域和關節表面的深度。已報道的人類關節軟骨細胞數量比本研究中鼻中隔軟骨的測量值低兩倍左右[10]，而文獻中測定的人股骨髁中的膠原蛋白和sGAG則比鼻中隔軟骨ECM中的值高。雖然關節軟骨和鼻中隔軟骨都歸為透明軟骨，但它們有不同的胚胎起源和內在固有的功能，這可能解釋了它們在組成上的一些差異[11]。本研究發現鼻中隔軟骨主要成分中軟骨細胞數和膠原蛋白含量在不同區域沒有明顯的變化。鼻中隔軟骨sGAG含量在不同區域有明顯的變化，膠原蛋白與sGAG的比值也有明顯的差異。此外，sGAG沉積的局部形態與鼻整形或鼻重建術中著重保留的L型支柱形狀相一致。

軟骨細胞ECM中某些結構分子的相對量影響軟骨的機械剛度、強度和穩定性。在人類關節軟骨中，糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）分子賦予組織固定的負電荷，增加組織膨脹和抗壓負荷的能力，而拉伸強度主要歸因于膠原蛋白網絡的作用[12]。軟骨中的sGAG（GAG的一種）側鏈負責其凈負電荷，吸引正離子和水進入ECM。關節軟骨中，膠原蛋白的含量是GAG含量的2～10倍，其含量取決于取樣組織的區域和組織承受的機械載荷[13]。機械強度和硬度與膠原蛋白與GAG的比值增加密切相關。在本研究中，人鼻中隔軟骨中膠原蛋白的平均含量約為sGAG含量的4.14倍，鼻中隔軟骨b、d區域sGAG含量明顯高于a、c區。基于上述對關節軟骨的研究，預測代表鼻中隔軟骨腹側的b、d區域也將具有更大的抗壓能力和韌性，這一特性與該區域的解剖基礎有關，即位于鼻中隔軟骨的基底部。

在鼻整形術和鼻部重建手術相關研究中，重點強調了鼻中隔軟骨的背側和尾側的L型支柱是支撐和維持鼻部穩定的關鍵區域之一，還為鼻部提供結構穩定性的作用[14-15]。這一區域的畸形或缺陷可造成美學和功能問題，如馬鞍鼻畸形、鼻尖位置不正、扭曲鼻；因此，本研究中報道的鼻中隔軟骨a、c區膠原蛋白與sGAG比值較高支持了這一假設，即該區域鼻中隔軟骨有更大的機械強度和硬度，科學地證實了L型支柱保留的價值。

組織工程重建的人鼻中隔軟骨組織若要適應人類體內環境，必須持久適應體內環境的力學需求，在形態學、組織學、生化和生物力學特性上都要與原生組織相似。本研究提供了人類鼻中隔軟骨組成成分的量化圖，組織工程化鼻中隔軟骨很有可能在未來頭頸部重建外科學上發揮作用。

綜上所述，深入了解人鼻中隔軟骨的天然成分，將作為設計符合特定重建目標的工程新技術的基礎。未來的實驗工作將包括繪制整個人類鼻中隔軟骨的力學特性。