瀕危植物大花黃牡丹根際土壤中一株青霉菌的分離與鑒定

祿亞洲 張二豪 尹秀

摘要 [目的]從西藏林芝縣米瑞鄉大花黃牡丹根際土壤中分離耐鹽青霉菌菌株，并對其分類地位進行鑒定。[方法]采用高鹽察氏培養基從大花黃牡丹根際土壤中分離青霉菌菌株，通過形態學觀察和rDNA轉錄間隔序列ITS測序的方法進行鑒定。[結果] ZP-01菌株菌落無特定形態，鏡下可見掃帚狀結構，屬于青霉菌（MF942929.1），同源性達99%。[結論]耐鹽青霉菌ZP-01在瀕危植物大花黃牡丹根際土壤微生物群落組成結構研究中具有重要意義。

關鍵詞 根際土壤;青霉菌;分離;鑒定

Abstract [Objective] To isolate Penicillium strain from the rhizosphere soil of Paeonia ludlowii in Mirui Township， Tibet， and identify its taxonomic status. [Method] The high salt Czapek s medium were used to isolate Penicillium strain from the rhizosphere soil of Paeonia ludlowii and identified by morphology and ITS sequencing. [Result] ZP01 formed membranous colony， the typical broom shaped penicillus was found under the microscope， after ITS sequencing， the homology of the Penicillium （MF942929.1） was 99%. [Conclusion] Salttolerant Penicillium ZP01 plays an important role in the study of soil microbial community structure in the rhizosphere of endangered plant Paeonia ludlowii.

Key words Rhizosphere soil;Penicillium;Isolation;Identification

青霉菌（Penicillium）屬于半知菌門絲孢菌綱的微生物[1]。因肉眼可觀其孢子顏色為藍綠色而得名。但并非所有青霉屬的霉菌都為藍綠色，也有白色或綠色[2]。常見于腐爛的水果、蔬菜、肉食及衣履上。筆者從大花黃牡丹根際土壤中分離得到一株青霉菌，并對其進行鑒定，旨在為大花黃牡丹根際土壤微生物種群及其多樣性研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

大花黃牡丹植物根際土壤采集于西藏林芝市林芝縣米瑞鄉（94°38′33.03″ E，29°32′43.96″N），所有樣品均隨機采取并混勻，每組3個重復，將采集的樣品放置無菌袋中低溫保存帶回實驗室，12 h內處理。

1.2 方法

菌種分離所用培養基為高鹽察氏培養基。采用土壤稀釋涂布法從大花黃牡丹土壤中分離微生物，將涂布好的高鹽察氏培養基平板倒置放于28 ℃的恒溫箱中培養5～7 d。 待培養皿上生長出不同菌落時，采用平板劃線法純化菌種，獲得純培養后制片鏡檢，并保存菌種。

利用ITS1和ITS4引物對真菌rDNA的ITS區域進行PCR擴增。PCR擴增采用20 μL反應體系：10×PCR Buffer 2.0 μL，5 mmol/L dNTPs 1.0 μL，5 μmol/L IST1-F引物1.0 μL，5 μmol/L IST4-R引物1.0 μL，rTaq Polymerase 0.2 μL，Template DNA 1.0 μL，補ddH2O至20 μL。PCR擴增條件：94 ℃ 5 min，30個循環（95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min），72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并純化PCR產物，將純化后的PCR產物送至上海美吉測序。

2 結果與分析

2.1 菌種的分離

通過稀釋涂布法從大花黃牡丹根際土壤中分離出一株霉菌，將其編為ZP-01，選定ZP-01作為進一步研究對象。

2.2 霉菌ZP-01的鑒定

2.2.1 形態學觀察。菌絲在培養基內外能廣泛蔓延，無假根或匍匐菌絲，不產生定形菌落。菌絲生長直立的多細胞分生孢子梗。梗的頂端不膨大，但具有可繼續再分的指狀分枝，每枝頂端有2～3個瓶狀細胞，其上各生一串灰色分生孢子（圖1）。

2.2.2 真菌ITS序列的PCR擴增、測序及系統發育分析。

以菌株ZP-01總 DNA 為模板，ITS1、ITS4為引物，進行PCR擴增，得到約500 bp 的特異性擴增條帶（圖2），圖2中2號條帶為菌株ZP-01 PCR產物目標條帶，PCR結果表明該菌為真核微生物，然后將純菌種穿刺送至上海美吉測序。

將測序結果，經過Blast比對，結果表明該菌屬于青霉屬。根據同源性比對結果，通過 Mega 5.0軟件構建系統發育樹（圖3）。結果表明ZP-01與青霉屬（Penicillium sp.）真菌聚在一群，其同源性均在 97%～99%，其中，ZP-01菌與Penicillium halotolerans（MF942929.1）的同源性最高，達99%，根據形態學觀察及系統發育分析，鑒定該菌為耐鹽青霉菌（Penicillium halotolerans）。

3 結論與討論

從大花黃牡丹根際土壤中分離得到的菌株ZP-01，通過顯微觀察和分子鑒定為真核微生物，ZP-01與青霉屬（Penicillium sp.）真菌聚在一群，其同源性均在 97%～99%，其中，ZP-01菌與Penicillium halotolerans（MF942929.1）的同源性最高，達99%，根據系統發育分析，鑒定該菌為耐鹽青霉菌（Penicillium halotolerans）。

淡紫擬青霉菌能產生類植物生長素，對植物具有防病促生作用[3]。任文彬[4]研究表明，淡紫擬青霉E2-4野生型菌株的孢子懸浮液對線蟲卵囊的孵化有抑制作用，用此菌制備的固體菌劑對番茄根結線蟲有較好的防治效果。肖馬云[5]研究發現淡紫擬青霉菌對香蕉枯萎病菌有顯著的抑制作用，有較好的防治效果，該菌及其生物肥藥在香蕉根系土壤和根圍還有較強的定殖能力。研究表明淡紫擬青霉菌劑對不同時期煙草生長均具有促生效果，在一定程度上提高煙草品質，并顯著增加煙草產量[6]。

部分青霉菌株在土壤中有較好的溶解磷作用。何迪等[7]、龔明波等[8]研究發現草酸青霉菌HB1具有分解纖維素和溶解土壤中固定態磷的雙重功能，還發現不僅對單子葉植物還是雙子葉植物都具有促進植物生長的作用。青霉菌與生物炭復合修復可以降低有效砷含量，并使砷污染土壤中的微生物環境有所改善，對砷污染土壤顯示出較好的修復性能[9]。

根系土壤是微生物的重要棲息地。不同來源的土樣中，微生物的種類和數目有很大差異[10]。根際是植物生長過程中微生物、植物和土壤互相作用，同時也是微生物生長的特殊生態環境[11-14]。

參考文獻

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