液相色譜-高分辨質譜測定貝類中蝦夷扇貝毒素

吳祥慶 楊姝麗 余燾

摘要 [目的]建立貝類產品中蝦夷扇貝毒素（YTX）的液相色譜-四極桿-靜電軌道場離子阱高分辨質譜檢測方法。[方法]以牡蠣和文蛤為研究對象，樣品經甲醇提取，采用QuEChERS凈化，經Hypersil GOLD C18色譜柱分離，乙腈和0.002 mol/L甲酸銨溶液（含0.2%甲酸）為流動相梯度洗脫，負離子全掃描+數據依賴二級掃描，提取一級譜圖中準分子離子精確質量數定量，二級質譜圖中特征離子精確質量數定性。[結果]蝦夷扇貝毒素（YTX）在12 min內出峰，定量限為0.3 μg/kg，在9.05～181.00 μg/L范圍內線性良好，相關系數r=0.996 4，回收率96.3%～102.8%，相對標準偏差（RSD）小于14.2%（n=6）。[結論]該研究為貝類毒素監控提供了技術支持。

關鍵詞 貝類毒素;蝦夷扇貝毒素;液相色譜-高分辨質譜

Abstract [Objective]The research aimed to establish a method for the simultaneous determination of Yessotoxins （YTX） in shellfish by liquid chromatographyquadrupoleorbitrap mass spectrometry.[Method]Oyster and clam samples were extracted with methanol and purified with QuEChERS technology.The analytes were isolated by Hypersil GOLD C18 column and gradient eluted with acetonitrile-0.002 mol/L ammonium formate solution （0.1% formic acid）.YTX were determined by orbitrap mass spectrometry through negative ion scanning， full scan mode and data dependent scan mode.[Result]The retention time of YTX was all within 12 min.The limits of quantification （LOQ） was 0.3 μg/kg.The calibration curves showed good linearity within the concentration range of 9.05-181.00 μg/L，r=0.996 4;the average recovery rate was 96.3%-102.8% and the relative standard deviations （RSD） were less than 14.2% （n=6）.[Conclusion] The study provides technical support for the monitoring of shellfish toxins.

Key words Shelfish toxin;Yessotoxins（YTX）;Liquid chromatographyhigh resolution mass spectrometry

貝類具有非選擇性濾食的習性，在海域生長過程中極易受到有毒微藻的污染。蝦夷扇貝毒素是一類多環聚醚海洋微藻毒素，最基本的結構為YTX，目前發現一百余種衍生物，但具體化學結構仍未完全確定。蝦夷扇貝毒素由網狀原甲藻、多邊舌甲藻和具刺膝溝藻產生，可大量累積在雙殼貝類體內，主要分布在消化腺、胰腺等組織中。食用受蝦夷扇貝毒素污染的貝類產品會對心臟、神經系統、免疫系統等造成損害[1-3]。蝦夷扇貝毒素廣泛分布于全球海域，對貝類產品食用安全的威脅不容忽視，歐盟第853/2004號法規規定蝦夷扇貝毒素總安全限量值為1 mg/kg。

檢測貝類毒素常用方法為小鼠生物法，但小鼠法不能區分貝類毒素的具體組分，準確性和靈敏度都較差，目前已逐漸被儀器檢測方法取代[4-5]。液相色譜-三重四極桿質譜法是檢測貝類毒素常用方法[6-8]，但由于分辨率低，貝類產品的基質復雜，容易出現假陽性結果。靜電場軌道阱高分辨質譜具有分辨率和靈敏度高的特點，能夠獲得碎片離子的精確質量數，現在已成為研究的新熱點[9-10]。該研究采用液相色譜-四極桿-靜電軌道阱高分辨質譜對貝類中蝦夷扇貝毒素（YTX）進行檢測，采用QuEChERS技術對樣品進行凈化，提高了樣品分析效率，為貝類毒素監控提供了技術支持，也為食品安全提供了可靠保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。貝類產品為近江牡蠣、文蛤，采集自欽州七十二涇、大風江貝類養殖區。用清水沖洗干凈貝類外殼，切斷閉殼肌，打開外殼，用純水沖洗泥沙等異物，取肌肉等可食用部分，作為試樣，瀝干后均質。冷藏運輸到實驗室，實驗室-18 ℃保存，備用。

1.1.2 主要儀器。U3000液相色譜（美國賽默飛世爾公司）;Q Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀（美國賽默飛世爾公司）;HM100均質器（北京格瑞德曼公司）;Centrifuge 5804R離心機（德國艾本德公司）;旋渦混合器（美國talboys公司）;Synergy純水儀（美國密理博公司）。

1.1.3 主要試劑。標準品：YTX（8.4±0.4 μg/mL），購自加拿大海洋生物科學研究所;甲醇、乙腈（色譜純，美國賽默飛世爾公司）;甲酸（色譜純，美國Sigma公司）;試驗用水由純水儀制備;C18、GCB、PSA、MgSO4基質分散固相萃取填料（上海安譜公司）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件。Hypersil GOLD C18色譜柱（1.9 μm，2.1 mm×100 mm）。流動相：A為乙腈，B為0.002 mol/L甲酸銨溶液（含0.2%甲酸）。梯度洗脫：0～1 min，30%A;1～7 min，30% A～90% A;7～10 min，90% A;10.1～12.0 min，30% A。流速0.2 mL/min。進樣體積5 μL。柱溫40 ℃。

1.2.2 質譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI）;掃描方式：負離子，一級全掃描+數據依賴二級掃描（FullMS+ddms2）;噴霧電壓：3 200 V;鞘氣流量：275 kPa;輔助氣流量：69 kPa;離子傳輸管溫度：320 ℃;一級掃描分辨率：70 000 FWHM;二級掃描分辨率：17 500 FWHM，歸一化碰撞能量：20、40、60 eV。

1.2.3 樣品前處理。準確稱取2.00 g（精確到0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇，渦旋混勻1 min，超聲提取5 min，8 000 r/min離心5 min，轉移上清液，殘渣再用10 mL甲醇重復提取1次，離心后合并上清液，加入1 g硫酸鎂、150 mg C18，漩渦混合30 s，8 000 r/min離心5 min，取10 mL上清液于50 ℃下氮吹至近干，用80%甲醇定容至1 mL，漩渦混合30 s，過0.22 μm濾膜，待儀器分析。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的選擇 根據歐盟2002/657/EC，質譜確證動物產品中的有機殘留物需要4個識別點。通過高分辨質譜獲得的母離子和子離子識別點分別為2.0和2.5 IPs，因此只需要獲得1個母離子和1個子離子，就能滿足對目標化合物的確證要求。

在該研究中，YTX采用負離子模式，選擇[M-H]-作為定量離子，精確質量數理論值為1 141.471 72，實際測定值為1 141.472 29，偏差0.5×10-6，質量準確度滿足要求。當定量離子強度達到8×104則觸發數據依賴的二級掃描，YTX特征二級碎片離子為[M-SO3-H]-，精確質量數為1 061.518 31，實際測定值為1 061.518 31，偏差3.2×10-6，二級質譜圖見圖1。

提取一級全掃描的精確質量數定量，二級碎片離子定性。在同樣測試條件下，樣品與標準物質保留時間相對偏差在±5%以內，且檢測到母離子與二級碎片離子的精確質量數與理論值相對偏差小于5×10-6，判定為陽性樣品。

2.2 色譜條件的選擇 該研究選用C18色譜柱，用乙腈和0.002 mol/L甲酸銨溶液（含0.2%甲酸）進行梯度洗脫，在“1.2.1”的色譜條件下，YTX在12 min內出峰，分析時間短，峰形尖銳，靈敏度高（圖2）。

2.3 樣品提取、凈化條件的優化

2.3.1 樣品提取條件的優化。根據YTX的結構、性質及相關文獻資料[11-14]，通過比較提取前、后加標的回收率，考察了用乙腈、甲醇、80%甲醇的提取效果。結果發現，3種提取劑的提取率均能達到90%以上。但乙腈提取液蛋白質等雜質較多，凈化效果較差;80%甲醇作為提取液在后續濃縮過程中不易吹干。因此，該研究采用甲醇作為提取劑。

2.3.2 樣品凈化條件的優化。QuEChERS技術是一種將固相萃取吸附劑分散到樣品萃取液中吸附雜質的凈化方法，廣泛應用于藥物殘留檢測中[15-16]。為降低貝類樣品中大量色素、脂肪、蛋白質的影響，該研究采用QuEChERS法對提取液進行凈化處理。通過在基質溶液中加標，添加不同固相萃取吸附劑，考察回收率方式，比較了C18、GCB、PSA這3種常用凈化劑的效果。單獨使用C18固相萃取劑時，凈化效果一般;添加PSA會使YTX回收率下降，這可能是由于YTX結構中含有2個磺酰基，PSA作為堿性吸附劑對YTX吸附較強;加入GCB后色素凈化效果較好，但是回收率較低。綜合考慮凈化效果與回收率，最終確定了使用2 g樣品加入150 mg C18固相萃取劑和1 g MgSO4。

2.4 線性范圍和檢出限 為避免凈化不完全帶來的基質效應，采用基質標準曲線進行定量。取空白基質樣品，按“1.2.3”樣品處理方法制得基質溶液，在基質溶液中加入標準品配成濃度為9.05、18.10、45.30、90.50、181.00 μg/L的基質標準溶液，按照“1.2.1”色譜條件和“1.2.2”質譜條件上機測定。以被測組分的峰面積響應值為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線，進行線性回歸，結果發現，在9.05～181.00 μg/L范圍內線性良好，相關系數r=0.996 4。按照母離子信噪比（S/N）=3和S/N=10確定檢出限（LOD）和定量限（LOQ），發現YTX檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.3 μg/kg。這表明該方法完全可以滿足貝類毒素日常檢測的需要。

2.5 準確度、精密度 選擇未檢出貝類毒素的牡蠣、文蛤作為空白基質樣品，分別添加3個濃度水平進行加標回收試驗，每個濃度水平做6個平行樣，結果見表1。從表1可以看出，在3個添加水平下蝦夷扇貝毒素（YTX）的平均回收率不小于96.3%，相對標準偏差（RSD）不大于14.2%。試驗結果表明，該方法的回收率和重現性較好。

2.6 樣品分析 應用所建立方法對56個貝類產品進行檢測，均未檢出蝦夷扇貝毒素（YTX）。

3 結論

通過QuEChERS技術結合液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質譜，能夠有效凈化貝類樣品基質中的各種雜質，快速測定貝類產品中蝦夷扇貝毒素。該方法快速簡單、靈敏度高、?線性良好，回收率、精密度均能滿足貝類產品中蝦夷扇貝毒素限量要求。

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