3個線粒體基因在紅鰭東方鲀和暗紋東方鲀中的比較分析

江馳航 胡子文 王智誠

摘要 由于形態學無法更精準地鑒別部分紅鰭東方鲀和暗紋東方鲀，因此需要通過分子手段鑒別此類無法直觀辨認的東方鲀。該研究以15尾紅鰭東方鲀和30尾暗紋東方鲀為材料，使用NCBI上紅鰭東方鲀和暗紋東方鲀的線粒體全基因組中3個基因COⅠ、COⅡ、COⅢ保守區域通過Primer 5.0進行引物設計。將45個樣品在摸索得到的最適條件下進行擴增并測序，對測序結果進行檢驗，分析種間差異并進行堿基組成性分析，得出COⅠ上有9個SNPs，COⅡ上有4個SNPs，COⅢ有10個SNPs，使用MEGA-X進行進化樹分析得出，該研究所設計的引物可以有效地鑒別2種東方鲀。

關鍵詞 紅鰭東方鲀;暗紋東方鲀;種質鑒定;分子標記

Abstract Because morphology cannot identify some Takifugu rubripes and Takifugu obscurus more accurately，molecular means must be used to identify such invisible Takifugu.In this study，15 T.rubripes and 30 T.obscurus were used. Three genes COⅠ，COⅡ，and COⅢ in the entire mitochondrial genome of T.rubripes and T.obscurus on NCBI were performed by Primer5.0 designed for primer design.Fortyfive samples were amplified and sequenced under the optimal conditions，and the sequencing results were checked. The differences between species were analyzed and base composition analysis was performed. It was found that there were 9 SNPs on COⅠ，4 SNPs on COⅡ and 10 SNPs on COⅢ. Using MEGA-X to analyze the phylogenetic tree，we can conclude that the primers designed in this study can effectively identify two Takifugu species.

Key words Takifugu rubripes;Takifugu obscurus;Germplasm identification;Molecular marker

紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）俗稱黑蠟頭、虎河豚，與暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）均屬于鲀形目（Tetraodontiformes）、鲀科（Tetraodontidae）、東方鲀屬（Takifugu），在我國分布于黃海、渤海、東海，是我國比較重要的幾種經濟養殖魚類之一，其味道鮮美，肉質細膩，魚皮富含膠原蛋白，魚肉蛋白質含量極高，而且其中所含有的河豚毒素也具有很高的價值，已在中國、日本以及韓國等亞洲國家廣泛培育[1-2]。

通過動物形態學去鑒別物種，是物種鑒別常見也是最基礎的方法，具有簡單直觀等優點。生物學具有悠久發展歷史，自動物解剖開始，到動物形態學，再到宏觀形態學研究，目前已發展成為包括解剖學、比較解剖學、細胞學和組織學、古動物學和胚胎學等的綜合性學科[3]。形態學方法可概括為可數性狀、可量性狀、結構特征等[4] 。但因為其判斷的主觀性強，需要比較專業的系統學知識，而且由于不同發育階段的形態學和地理隔絕也存在著差異，容易導致判斷的錯誤，因此需要更精確的鑒定方式去鑒別形態學中無法辨認的隱形種。

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種應用分子生物學將目的DNA片段在生物體外放大擴增的一項技術，其利用DNA在高溫時破壞氫鍵變性成單鏈，降溫時復性使引物（能與目的基因互補配對的寡核苷酸片段）與目的基因單鏈結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度72 ℃，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖（5′—3′）的方向合成互補鏈[5]。通過對不同物種基因的保守區段設計引物，可應用該技術獲得多個物種的同一基因的類似片段，比較這些基因片段的差異程度可判斷這些物種的親緣關系及區別鑒定這些物種。線粒體DNA（mtDNA）是一種在進化過程中替換率比DNA的高5～10倍并廣泛存在于生物體內的遺傳物質，已經被廣泛利用于動植物的種群遺傳學研究[6-7]，其中COⅠ基因是細胞色素氧化酶3個亞基基因中的一個相當保守的蛋白質編碼基因，基因組中很少存在插入和缺失，其普遍替代速率為0.016 8～0.023 0每個位點/每百萬年[8-9]，長為658 bp左右的十分適合解析親緣關系相近的分類類群[10]。國內外已經有研究者通過此段序列對未知物種進行系統的分類，并且打破傳統形態學的物種分類[11-12]，COⅡ與COⅢ同樣存在于mtDNA中，其組成也是十分保守。

SNP是單核苷酸多態性 （single nucleotide polymorphism），屬于第三代分子標記技術，是在基因組水平上的單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性，具有可以穩定遺傳的優點，故此通過查找在不同物種間存在的SNP能有效地將這些物種加以區分，同樣當某一物種的不同性狀出現SNP時，則可以利用對SNP的篩選進行育種。 該方法已有應用的先例，Lin等[13]利用 SNP 成功建立了大黃魚有效的鑒定遺傳性別的方法。

該研究使用多條紅鰭東方鲀與暗紋東方鲀，通過查找在兩種群間有差異而在群體中無差異的SNP作為鑒定兩種群差異的分子標記。通過設計引物在PCR反應中將這些存在于遺傳信息中的差異放大，借助測序技術及生物分析篩出這些可作為分子標記的SNP。檢測這些SNP可鑒別這兩群體間難以通過形態學鑒定個體，可應用于養殖育種、食品檢疫、生態環保等領域。

2.4 2種東方鲀基因進化樹分析

使用MEGA-X中的鄰接法（NJ）模型，使用其測序修剪長度的DNA片段構建所有個體的系統發育樹（圖5～7），檢驗方法使用Bootstrap method重復 1 000次。在3個基因的進化樹中紅鰭東方鲀15個個體（圖中編號為31～45）和暗紋東方鲀30個個體（圖中編號為1～30）分別聚為一支，說明所設計的這3對基因引物的擴增產物能有效地區分紅鰭東方鲀和暗紋東方鲀。

3 討論

近些年來，分子標記在水產動物遺傳育種中的應用越來越廣泛。SNP具有普遍性、穩定性且檢測十分簡便，而且部分特殊SNP可以直接影響生物本身的性狀，SNPs也會根據地理環境的不同具有不同的性狀特點[14]。

該研究以45個紅鰭東方鲀和暗紋東方鲀肌肉組織為材料，在COⅠ中篩選出了9個種間特異性SNPs，均為同義突變;在COⅡ中篩選出了4個種間特異性SNPs，其中A371G發生了錯義突變，紅鰭東方鲀密碼子為GTC即纈氨酸，暗紋東方鲀為ATC即異亮氨酸，均位于線粒體內膜外。在暗紋東方鲀COⅡ中的第385位發生了錯義突變，密碼子由ACC突變為GCC，氨基酸由蘇氨酸突變為丙氨酸，均位于線粒體內膜外。

在COⅢ中篩選出了10個種間特異性SNPs，其中T310G發生了錯義突變，紅鰭東方鲀密碼子為GCA即丙氨酸，暗紋東方鲀為TCA即絲氨酸，位置在非跨膜區。

這些篩選出的23個SNPs可作為鑒別2種東方鲀的分子標記，并且等位基因數是反映某一位點在進化過程中所積累遺傳變異程度的重要指標。等位基因數越高表明此位點在進化歷史上的突變越活躍，該物種有多種方式適應自然選擇，對復雜生存環境的適應力也越強[15-16]。紅鰭東方鲀群體數少但是 變異位點數更多，說明紅鰭東方鲀所處環境更復雜。

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