玉米雜交種新科910指紋圖譜構(gòu)建及其純度鑒定

張瑞平 王文潔 王蕊

摘要 利用60對(duì)分布于玉米10條染色體上的引物，對(duì)新科910及其父母本進(jìn)行SSR分析。從中篩選出15對(duì)條帶清晰、重復(fù)性好的引物，用于構(gòu)建新科910指紋圖譜，并將其數(shù)字化，計(jì)算出出現(xiàn)相同指紋圖譜的概率為4.44×10-16，概率極低，說(shuō)明以這15對(duì)引物構(gòu)建的新科910指紋圖譜鑒定其真實(shí)性是可行的。這15對(duì)引物分別是phi96100y1、umc2105k3、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg161k8、phi299852y2、umc2160k3、umc1125y3、bnlg240k1、umc2084w2、umc1231k4、phi041y6、umc1432y6、umc2163w3。其中，umc1705w1、bnlg2305k4、umc1432y6、umc2084w2、phi041y6、umc2163w3這6對(duì)引物可用來(lái)鑒定新科910純度。任選1對(duì)引物umc2084w2用來(lái)檢測(cè)新科910的純度，結(jié)果為97.30%，與預(yù)期結(jié)果（97%）基本相符。因此，用這6對(duì)引物來(lái)鑒定新科910純度是可行的、結(jié)果是可信的。

關(guān)鍵詞 玉米;新科910;SSR;指紋圖譜;純度

Abstract We used 60 pairs of primers which distribute on the 10 chromosomes of maize for the SSR analysis of the maize hybrid Xinke 910 and its parents.15 pairs of primers were selected which were clear and good repeatability of their electrophoresis strip to construct the fingerprint of Xinke 910. And we digitized the fingerprint of Xinke 910 to calculate the probability of the same fingerprint，which was 4.44×10-16 and this probability was very low.This explains that it is feasible to identify the authenticity of Xinke910 by the fingerprint which is constructed by the 15 pairs of primers.The 15 pairs of primers were phi96100y1，umc2105k3，bnlg2291k4，umc1705w1，bnlg2305k4，bnlg161k8，phi299852y2，umc2160k3，umc1125y3，bnlg240k1，umc2084w2，umc1231k4，phi041y6，umc1432y6，umc2163w3. There were 6 pairs of primers can be used to identify the purity of Xinke 910 which were umc1705w1，bnlg2305k4，umc1432y6，umc2084w2，phi041y6 and umc2163w3.Among them， we selected 1 pair of primer arbitrary， which was umc2084w2 to identify the purity of Xinke 910，the result was 97.30%， which fit the expected results（97%） basically. Therefore， it was feasible and the results were credible to identify the purity of Xinke 910 by the 6 pairs of primers.

Key words Maize;Xinke 910;SSR;Fingerprint;Purity

玉米是世界三大糧食作物之一，我國(guó)是玉米生產(chǎn)大國(guó)，2012年我國(guó)玉米總產(chǎn)量首次超過(guò)水稻，成為第一大糧食作物[1]。雜交玉米種子的純度嚴(yán)重影響著作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，同時(shí)也是種子生產(chǎn)和質(zhì)量管理中最棘手的問(wèn)題[2]。因此，快速、準(zhǔn)確、有效鑒定玉米雜交種的純度和真實(shí)性是十分必要的。傳統(tǒng)的玉米種子純度檢測(cè)方法有形態(tài)鑒定法、幼苗鑒定法、田間小區(qū)種植鑒定法等，但存在周期長(zhǎng)，易受環(huán)境影響、準(zhǔn)確性差等不足之處[3]。此外，我國(guó)生產(chǎn)使用的玉米自交系主要是塘四平頭、旅大紅骨、蘭卡斯特和瑞德，遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄，因此以傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記鑒別品種日趨困難。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，RFLP、RAPD、AFLP、SSR等分子水平上的技術(shù)日趨成熟。其中，SSR標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物遺傳、育種種群鑒定、種子純度檢驗(yàn)等研究中[4]。SSR具有快速、準(zhǔn)確、信息含量高、呈共顯性分離、易于分析、重復(fù)可靠等優(yōu)點(diǎn)[5-7]，在玉米指紋圖譜構(gòu)建、品種真實(shí)性鑒定以及純度檢驗(yàn)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，并成功商業(yè)化[8]。

玉米雜交種新科910由河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育，2014年5月通過(guò)河北省品種審定委員會(huì)審定，審定編號(hào)為冀審玉2014011。為快速有效鑒定市場(chǎng)流通的新科910種子的真實(shí)性和純度，筆者利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，用60對(duì)引物（包括40對(duì)核心引物）對(duì)新科910及其親本進(jìn)行SSR-DNA指紋圖譜分析，并將其數(shù)字化，計(jì)算出現(xiàn)相同指紋圖譜的概率，從而篩選出能有效鑒定新科910純度的引物，以期更準(zhǔn)確鑒定和保護(hù)該品種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和主要試劑

雜交種新科910及其父本H865和母本K381均由河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米課題提供;試驗(yàn)所用60對(duì)SSR引物序列信息來(lái)自玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.maizegdb.org/ssr.php），并由上海生物工程股份有限公司合成;試驗(yàn)所用DNA聚合酶、dNTP購(gòu)買(mǎi)于寶生物生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取。

1.2.1.1 用于構(gòu)建指紋圖譜DNA提取方法。

將新科910及其親本的玉米種子沙培，于30 ℃光照培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，待玉米苗長(zhǎng)至3葉1心，取葉片混樣，用CTAB方法提取總DNA[9]。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度，加水稀釋至25 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 檢測(cè)純度用DNA提取。

取新科910種子100粒（其中有3粒是人為加入的母本種子）沙培，于30 ℃光照培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，待玉米苗長(zhǎng)至3葉1心時(shí)，用CTAB方法提取單株DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 擴(kuò)增體系及電泳分析。PCR擴(kuò)增體系總體積為15 μL，其中dNTPs 0.2 mmol/L，引物0.25 μmol/L和模板DNA 25 ng，加滅菌純水補(bǔ)足體積。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃40 s，60 ℃35 s，72 ℃45 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在BIOER TC-96/G/H（b）型PCR儀上進(jìn)行。

擴(kuò)增產(chǎn)物加入適量上樣緩沖液6×Loading Buffer混勻后，各取3.5 μL在8.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，銀染顯色。然后在膠片觀測(cè)燈上觀察電泳結(jié)果，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描圖片或者用相機(jī)拍照保存圖片。

1.2.3 指紋圖譜構(gòu)建及數(shù)字化。篩選SSR產(chǎn)物帶型穩(wěn)定且清晰的引物，構(gòu)建新科910的指紋圖譜。并以1、0統(tǒng)計(jì)建立數(shù)據(jù)庫(kù)，將新科910指紋圖譜數(shù)字化。在相同遷移位置（分子量相同片段）有帶記為1，無(wú)帶記為0。根據(jù)公式P=1/2n計(jì)算相同指紋圖譜有可能出現(xiàn)的概率[10-11]，式中2為相同遷移率位點(diǎn)上等位基因存在的“有”或“無(wú)”2種關(guān)系;n為等位基因的數(shù)目;2n為檢測(cè)n個(gè)等位基因時(shí)有可能涉及的所有自交系的個(gè)數(shù)。

1.2.4 種子純度鑒定。根據(jù)構(gòu)建新科910的指紋圖譜，篩選出可用作純度鑒定的引物，再?gòu)闹腥芜x1對(duì)，用來(lái)驗(yàn)證其鑒定純度的可行性。

根據(jù)公式：種子純度=[（供檢測(cè)品種種子樣本帶型數(shù)-雜種種子樣本帶型數(shù)）/供檢測(cè)品種種子樣本帶型數(shù)]×100%，計(jì)算樣本種子純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物篩選

從60對(duì)用于擴(kuò)增新科910及其父母本的引物中，篩選出帶型穩(wěn)定清晰、重復(fù)性好的引物15對(duì)，用于構(gòu)建新科910的指紋圖譜。這15對(duì)引物分布于玉米的9條染色體上，共檢測(cè)出51個(gè)等位基因，每對(duì)引物可檢測(cè)出2～6個(gè)等位基因，平均3.4個(gè)，片段大小為100～400 bp（表1）。

2.2 指紋圖譜構(gòu)建 篩選出的可用于構(gòu)建新科910指紋圖譜的15對(duì)引物分別是phi96100y1、umc2105k3、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg161k8、phi299852y2、umc2160k3、umc1125y3、bnlg240k1、umc2084w2、umc1231k4、phi041y6、umc1432y6、umc2163w3，其擴(kuò)增的主條帶為100～400 bp。這15對(duì)引物擴(kuò)出的新科910的主條帶均是父本和母本主條帶的疊加，這很好地印證了SSR分子標(biāo)記共顯性的遺傳特點(diǎn)[12]。部分引物擴(kuò)增結(jié)果如圖1。

可用作純度檢測(cè)引物有6對(duì)，分別是umc1705w1、bnlg2305k4、umc1432y6、umc2084w2、phi041y6、umc2163w3。其中，引物umc1705w1、bnlg2305k4、umc1432y6擴(kuò)增條帶為200～300 bp，條帶清晰，片段大小差距較大，可用作新科910純度鑒定;引物umc2084w2擴(kuò)增條帶為100～200 bp，條帶清晰，片段大小差距較大，且父母本均只有1條條帶，可用作新科910 bp純度鑒定;phi041y6和umc2163w3擴(kuò)出的條帶為200～400 bp，條帶清晰穩(wěn)定，片段大小差距較大，且父母本均只有1條主條帶，可用作新科910純度鑒定。

2.3 指紋圖譜數(shù)字化

將15對(duì)引物擴(kuò)出的片段數(shù)字化，分別用1和0表示，由表2可知，新科910及其父母本均由順序不同的51位數(shù)字組成。以父本H865為例，出現(xiàn)與其完全相同數(shù)字順序的概率大約為4.44×10-16（P=1/251），即在大約2.252×1015份材料中只有1份材料與其指紋號(hào)碼相同，概率極低。所以可以推斷這個(gè)數(shù)字指紋圖譜是其特有的。同理，新科910及其母本的數(shù)字指紋也是特有的，再一次證明了這15對(duì)引物可用于新科910及其父母本真實(shí)性鑒定。

2.4 種子純度鑒定

從6對(duì)可用于純度鑒定的引物中任選1對(duì)（umc2084w2）鑒定新科910的純度，結(jié)果見(jiàn)圖2。

引物umc2084w2檢測(cè)新科910的純度為97.30%。由圖2可知，第26泳道條帶與母本一致，應(yīng)該是人為加入的母本種子，這與100粒新科910種子中有3粒人為混入的母本種子的結(jié)果（97%）基本相符，說(shuō)明這些引物對(duì)新科910純度鑒定結(jié)果較可信。

3 結(jié)語(yǔ)

（1）該研究用分布于玉米10條染色體上的60對(duì)引物（包括40對(duì)核心引物）對(duì)玉米雜交種新科910及其父母本進(jìn)行SSR分析，篩選出15對(duì)引物可用來(lái)構(gòu)建新科910及其父母本的指紋圖譜，并將指紋圖譜數(shù)字化，計(jì)算出出現(xiàn)相同指紋圖譜的概率為4.44×10-16，概率極低，可以說(shuō)這15對(duì)引物所構(gòu)建的新科910及其父母本的指紋圖譜是特有的，這為雜交種新科910的真實(shí)性鑒定提供了參考。