甲醇對α-淀粉酶活力及構象影響的研究

張建榮

摘要：目的：研究甲醇對α-淀粉酶活性及構象的影響。方法：擬合米氏方程求得Km.Vmax，并探討甲醇對α-淀粉酶的活性影響。結果：以0.5%的淀粉為底物，加甲醇時km=0.265mol/L，Vmax=88.496U/min.g，不加甲醇時km=0.0442m01/L，Vmax=88.495U/min.g，由此可知甲醇濃度在10%-50%范圍內時，其對α-淀粉酶具有抑制作用。結論：本實驗為進一步研究淀粉酶抑制劑提供理論基礎。

關鍵詞：淀粉;麥芽糖;α-淀粉酶;抑制劑

α-淀粉酶主要催化斷開淀粉中α-，4糖苷鍵，并具有淀粉的液化和糖化作用，α-淀粉酶是影響飲食中淀粉等消化、吸收的關鍵酶，抑制其活性可以延緩人體對淀粉的降解和葡萄糖的吸收，從而抑制餐后血糖的快速升高。因此α-淀粉酶抑制劑常被用于治療糖尿病。由于尋求α-淀粉酶抑制劑的成本高，人們更多地從廉價的化學藥品中尋找高效的α-淀粉酶抑制劑，因此成為研究的熱門話題。在研究α-淀粉酶的基礎上，本研究主要探討甲醇對α-淀粉酶的抑制效果。

一、材料與設備

（一）材料

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、淀粉、麥芽糖、α-淀粉酶、甲醇、DNS、蒸餾水。

（二）設備

電熱恒溫水浴鍋（HH-S4型）：北京科偉永興儀器有限公司;島津分析天平（AUY220）、UV-250：日本島津;722可見分光光度計;PHS-3D雷磁PH計：上海精科。

二、研究方法

（一）麥芽糖標準曲線的制作

取8支干凈的試管，量取1mg/ml的麥芽糖，體積（m1）分別為0，0.2，0.6，1.0，1.4，1.8，2.0，在37℃下保溫3min，再加入DNS試劑2ml，沸水浴5min，流水冷卻，蒸餾水定容至25m1，在540nm處測OD值。

（二）α-淀粉酶活性的測定

1.取5支干凈的試管，分別編號1-5。

2.準確量取0.5%的淀粉0.5ml于5個試管中，每個試管中加入對應的甲醇濃度為10%，20%，30%，40%，50%，樣品管中分別加入10mg/ml的淀粉酶0.5m1，5只試管分別用蒸餾水補齊至2.0m1.

3.2.3、37℃下保溫3min，然后加入DNS試劑2ml，沸水浴5min，流水冷卻，蒸餾水定容至25ml，在540nm處測OD值。

（三）用1/s和1/v雙倒數法作圖計算Km和Vm

1.取8支干凈的試管，分別編號1和1，2和2，3和3，4和4，1，2，3，4號管做為對照。

2.準確量取0.5%的淀粉溶液0.05ml于1和1試管中再加入甲醇0.8ml，1號管中加入lmg/ml的淀粉酶0.5ml，然后兩試管用蒸餾水補齊至2ml;準確量取0.5%的淀粉溶液0.1ml于2和2試管中，再加入甲醇0.8ml，2號管中加入1mg/ml的淀粉酶0.5ml，然后兩試管用蒸餾水補齊至2ml;準確量取0.5%的淀粉溶液0.2ml于3和3試管中，再加入甲醇0.8ml，3號管中加入1mg/ml的淀粉酶0.5ml，然后兩試管用蒸餾水補齊至2ml;準確量取0.5%的淀粉溶液0.4ml于4和4號試管中，再加入甲醇0.8ml，4號管中加入1mg/ml的淀粉酶0.5ml，然后兩試管均用蒸餾水補齊至2ml。

3.37℃下保溫3min，再加入DNS試劑2ml，沸水浴5min，流水冷卻，蒸餾水定容至25ml，在540nm處測OD值，根據方程1/V=（1/[S]）Km]Vmax+1/Vgmax，以1/V為縱坐標，1/[S]為橫坐標作圖，求得Km及Vmax值。

（四）用1/s和1/v雙倒數法作圖計算Km和Vm

不加甲醇，其它操作同上3.3。

（五）不同濃度甲醇處理后α-淀粉酶紫外吸收光譜

1.取7支干凈的試管，分別編號0，0，1，2，3，4，5。

2.準確量取0.5 mllOmg/ml的淀粉酶于每支試管中，依編號向每支試管中分別加入甲醇0，5%，10%，20%，30%，40%，再用PH6.8的磷酸緩沖液補齊至3ml，室溫靜致20分鐘。

3.測α-粉酶的紫外吸收光譜。

三、結果

（一）麥芽糖標準曲線的制作

如圖-1所示麥芽糖的標準曲線的相關系數R2=0.9983，能夠符合本實驗的基本要求。

（二）在不同抑制劑濃度下α-淀粉酶活性的測定

由圖-2可知，在酶反應體系中加入濃度分別為10%，20%，30%，40%，50%甲醇，結果發現甲醇對α-粉酶具有抑制作用，且甲醇濃度大于10%時抑制效果越明顯。

（三）用1/s和1/v雙倒數法作圖計算Km和Vm

將米氏方程V=Vmax·[S]，（Km+[S]）轉化為I/V=（Knl/Vmax）·（1/[S]）+1/Vmax形式，作出1/VO對1/[S]的雙倒數圖，可根據圖形求出km和vm，進而推出相應的米氏方程。對實驗結果進行處理做出1/VO～I/[S]圖，如圖-3所示。不加甲醇時得Km=0.0442mol/L，Vmax=88.495U/min.g，相應的動力學方程為V=88.495[$]/（0.0442+[S]），加甲醇時求得Km=0.265mol/L，Vmax=88.496U/min.g，相應的動力學方程為V=88.496[S]/（0.265+[S]）。由圖-3知Vmax幾乎不變而Km增大，說明加入甲醇后α-淀粉酶對底物的親和力減小，甲醇對于α-淀粉酶來說是一種競爭性抑制劑。

（四）不同濃度甲醇處理后α-淀粉酶紫外吸收光譜

在室溫條件下，測定甲醇濃度分別為0，5%，10%，20%，30%，40%時，α-淀粉酶紫外吸收光譜。

由圖-5可知，淀粉酶在280nm處有紫外吸收峰，這主要是由Trp和Tyr引起，隨著甲醇濃度的增加，淀粉酶紫外吸收值開始下降。

四、結語

本實驗在研究α-淀粉酶活性時，只做了甲醇濃度大于10%的部分，在該范圍內抑制效果明顯，在0-10%范圍內既有抑制作用又有促進作用，經討論該范圍內甲醇的抑制實驗不做。本實驗操作簡單易行，為進一步研究淀粉酶抑制劑提供理論基礎，以0.5%淀粉為底物，加甲醇時km=0.265mol/L，Vmax=88.496U/min.g，不加甲醇時km=0.0442mol/L，Vmax=88.495U/min.g，由此可知甲醇對α-淀粉酶是競爭性抑制劑。