健脾補腎方對再生障礙性貧血患者和Fas表達的影響

呂麗麗 張琳琳 曹宇峰 王磊 邊月平

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2016年1月至2018年6月我院收治的90例再生障礙性貧血患者納入研究范圍，按照隨機數字表法隨機分為對照組和治療組，每組45例。對照組男25例，女20例；年齡32～61歲，平均(39.12±5.42)歲；病程1～12年，平均(5.12±0.73)年；中醫癥候分型：脾腎陰虛型10例，脾腎陽虛型19例，脾腎陰陽兩虛型16例；治療組男23例，女22例；年齡30～65歲，平均(40.00±5.51)歲；病程1～14年，平均(5.78±0.82)年；中醫證候分型：脾腎陰虛型12例，脾腎陽虛型18例，脾腎陰陽兩虛型15例。2組年齡、性別比、病程、中醫證候分型等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組一般資料比較 n=45

1.2 納入及排除標準 納入標準：(1)符合《血液病診斷及療效標準》制定的再生障礙性貧血診斷標準，且經臨床癥狀體征、血常規指標、骨髓涂片及病理學檢查確診為AA；(2)符合《中藥新藥臨床研究指導原則》制定的中醫辨證分型診斷標準；(3)入組前2周內未接受過激素、化療藥物治療者；(4)患者均自愿參加本研究，且簽署知情同意書。排除標準：(1)合并PNH、白血病等其他血液系統疾病；(2)合并心﹑肝﹑肺﹑腎等重要臟器功能不全者；(3)妊娠或哺乳期女性；(4)對本研究藥物過敏或有禁忌癥者。

1.3 治療方法 對照組給予環孢素A(杭州中美華東制藥有限公司)治療，口服，4 mg·kg-1·d-1，2次/d；同時根據病情給予抗感染、補血及止血藥物。治療組給予健脾補腎方治療，組成：黃芪24 g，女貞子15 g，太子參24 g，白術芍15 g，炒丹皮15 g，制半夏10 g，小薊草15 g，菟絲子24 g，炒枳殼10 g，炙甘草6 g。1個月為1個療程，共治療2個療程。針對不同中醫辨證分型，健脾補腎方中分別配伍不同中藥，脾腎陰虛型可選擇滋陰生精的藥物，如生地黃、黃柏等；脾腎陽虛型可選擇填精助陽的藥物，如補骨脂、淫羊藿；脾腎陰陽兩虛型可選擇陰陽雙補的藥物，如杜仲、制首烏等。

1.4 觀察指標及方法

1.4.2 BMNC自噬、凋亡相關基因mRNA表達：采用Real time-PCR法測定BMNC LC3-Ⅱ、Bcl-2、caspase-3、PARP mRNA表達。按照TRizol說明書進行BMNC總RNA的提取和逆轉錄，SYBR Green染料法進行目的基因擴增，根據RQ=2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。見表2。

表2 Real time-PCR引物序列

1.4.3 BMNC自噬、凋亡相關基因蛋白表達：采用Western blot檢測BMNC LC3-Ⅱ、Bcl-2、caspase-3、PARP蛋白表達。提取BMNC總蛋白，BCA法定量蛋白，SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入特異性一抗(1∶5 000稀釋)，4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記的抗兔 IgG(1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h，PBS洗膜3次，以GAPDH為內參照基因，ECL反應，采用Image-Pro Plus軟件分析目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.2 2組BMNC細胞凋亡率比較 治療前2組BMNC細胞凋亡率比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療后2組BMNC細胞凋亡率均明顯低于治療前，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，且治療組凋亡率低于對照組(P<0.05)。見表4。

組別CD+34Fas對照組 治療前0.31±0.0445.16±5.89 治療后0.48±0.06?30.32±3.67?治療組 治療前0.33±0.0543.87±6.46 治療后0.65±0.09?#17.36±2.50?#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

組別凋亡率對照組 治療前7.25±0.87 治療后4.90±0.65?治療組 治療前7.29±0.96 治療后2.12±0.33?#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

2.3 2組BMNC自噬相關基因表達比較 治療前2組BMNC LC3-Ⅱ mRNA和蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療后2組BMNC LC3-Ⅱ mRNA和蛋白表達均明顯高于治療前，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，且治療組LC3-Ⅱ mRNA和蛋白表達高于對照組(P<0.05)。見表5。

組別LC3-Ⅱ mRNALC3-Ⅱ蛋白 對照組 治療前0.34±0.050.30±0.04 治療后0.55±0.08?0.49±0.07?治療組 治療前0.32±0.040.29±0.05 治療后0.87±0.10?#0.80±0.11?#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

2.4 2組BMNC凋亡相關基因表達比較 治療前2組BMNC Bcl-2、caspase-3、PARP mRNA和蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療后2組BMNCBcl-2 mRNA和蛋白表達均明顯高于治療前，caspase-3、PARP mRNA和蛋白表達均明顯低于治療前，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，且治療組Bcl-2 mRNA和蛋白表達高于對照組，caspase-3、PARP mRNA和蛋白表達低于對照組(P<0.05)。見表6。

組別Bcl-2mRNA蛋白caspase-3mRNA蛋白PARPmRNA蛋白對照組 治療前0.42±0.060.37±0.051.02±0.150.98±0.120.95±0.120.89±0.10 治療后0.63±0.09?0.60±0.08?0.79±0.11?0.72±0.09?0.67±0.11?0.60±0.09?治療組 治療前0.40±0.050.34±0.040.99±0.120.95±0.130.97±0.130.91±0.12 治療后0.99±0.12?#0.90±0.10?#0.40±0.06?#0.35±0.05?#0.38±0.07?#0.31±0.04?#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

3 討論

自噬是真核細胞內自噬溶酶體介導的大分子物質降解為氨基酸等基礎物質的過程，對細胞生長發育、分化、凋亡等發揮重要調控作用[11]。自噬異常時細胞內代謝紊亂從而引發腫瘤、心血管、自身免疫等多種急慢性疾病發生。越來越多的證據表明自噬參與調控骨髓造血過程，自噬異常與AA等多種惡性血液系統疾病密切相關，自噬水平變化在AA發生發展中的作用已經成為當前研究的熱點[12-14]。自噬作用的激活往往伴隨著LC3-Ⅱ表達升高，該因子在調控自噬體形成及成熟中發揮重要作用，可作為反映細胞自噬程度的可靠指標。臨床研究表明，AA患者造血干(祖)細胞LC3-Ⅱ表達較健康人顯著降低，且與疾病嚴重程度呈負相關，經免疫抑制劑治療后LC3-Ⅱ表達有所恢復，說明AA患者存在自噬缺陷，這可能是導致造血干(祖)細胞凋亡的重要原因[15]。但是，自噬缺陷在AA發病機制中的作用尚不清楚。基礎研究表明，敲除小鼠造血干細胞自噬基因后不僅不能夠維持細胞靜息狀態，還會影響其自我更新，同時導致細胞過度增殖分化。體外實驗表明，自噬基因敲除后造血干細胞集落形成能力顯著降低[16]。此外，造血微環境作為骨髓造血干細胞增殖分化的場所，參與調控造血干細胞的自我更新及定向分化，造血微環境的破壞會影響造血干細胞的分化增殖能力，從而導致AA發生[17]。研究發現，AA患者骨髓腔脂肪細胞數量顯著增加，造血干細胞數量減少，導致造血微環境損傷，這是AA發生發展的重要原因[18,19]。而采用自噬激活劑雷帕霉素通過上調骨髓間充質干細胞自噬水平降低其成脂性和脂肪細胞數量，改善骨髓造血微環境，這有利于造血干細胞增殖分化。近年來，隨著免疫抑制劑在AA臨床治療中的廣泛應用，免疫紊亂導致的造血組織損傷是AA發生發展的重要病理機制，而自噬在維持免疫穩態中的作用也越來越受到重視，自噬異常通過破壞免疫平衡導致AA等自身免疫性疾病發生。Pileston等[20]研究發現敲除小鼠自噬基因后將會破壞Th1/Th2細胞平衡，從而導致免疫紊亂。以上研究表明，自噬通過調控造血干細胞增殖分化、靜息態維持、免疫功能等多種機制導致AA等免疫相關疾病發生發展。但健脾補腎方是否通過調控自噬活性發揮治療作用尚不明確。本研究通過Real time-PCR和Western blot檢測AA患者BMNC自噬、凋亡相關基因表達變化，結果顯示，治療后2組BMNC LC3-Ⅱ、Bcl-2 mRNA和蛋白表達均明顯高于治療前，caspase-3、PARP mRNA和蛋白表達均明顯低于治療前，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，且治療組Bcl-2 mRNA和蛋白表達高于對照組，caspase-3、PARP mRNA和蛋白表達低于對照組(P<0.05)。說明自噬缺陷和細胞凋亡在AA發病中發揮一定作用，健脾補腎方能夠通過上調自噬標志性基因表達，下調凋亡基因表達誘導細胞自噬并抑制其凋亡，這可能是其發揮治療作用的分子機制之一。