lando雙層人工真皮修復材料與自體刃厚皮片移植對創(chuàng)面細胞因子的影響

苑莎莎 范煒 王香坤 焦建強 梁清國 李燁

真皮的重建和再生，在皮膚缺損患者的皮膚修復中具有至關重要的意義，其關系創(chuàng)面愈合的質(zhì)量，可以保證永久性創(chuàng)面覆蓋[1]。傳統(tǒng)的自體皮片移植治療可以避免免疫排斥，取得很好的治療效果[2]，但是容易遺留供皮區(qū)瘢痕，而且對于大面積燒傷以及幼兒等特殊患者的治療有很大困難。真皮替代物的出現(xiàn)是解決這一問題的關鍵。自Integra LifeSciences公司在20世紀80年代開發(fā)的Integra以來[3]，人工真皮在短短的幾十年時間里得到了迅速的發(fā)展。Integra的真皮替代部分是由牛肌腱中提取的Ⅰ型膠原與6-硫酸軟骨素交聯(lián)形成的，表皮替代物是硅膠膜。人工真皮的誕生對于減少供區(qū)損傷，改善新生組織外觀具有重要意義[4,5]。以往人工修復材料均為進口，常見的有日本進口的Pelnac等[6,7]。2017年8月深圳蘭度生物材料有限公司生產(chǎn)的Lando雙層人工真皮修復材料獲CFDA批準上市，屬國內(nèi)首家。Lando雙層人工真皮修復材料下層為牛跟腱Ⅰ型膠原與硫酸軟骨素交聯(lián)制成的仿真皮部分，上層是半透膜性質(zhì)的醫(yī)用硅橡膠層。以往研究表明，其具有很好的皮膚創(chuàng)面修復功能[8,9]。但目前臨床研究主要集中在以動物為研究對象，針對人體的相關研究仍然較少，臨床數(shù)據(jù)不完善，缺乏更加有力和全面的數(shù)據(jù)支持。本研究討論lando雙層人工真皮修復材料與自體刃厚皮片聯(lián)合移植對創(chuàng)面細胞因子的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究采用前瞻性研究方法。選擇我院2016年6月至2019年3月收治的關鍵功能部位深度燒傷患者57例(包括燒傷部位共82處)。其中男34例，女23例；年齡3～57歲，平均(21.4±4.6)歲；傷后24～120 h，平均(56.4±15.2)h；熱液燙傷30例，火焰燒傷14例，電燒傷13例；創(chuàng)面為深Ⅱ度～Ⅲ度，面積4%～22%；燙傷后形成瘢痕攣縮15例。植皮部位：手背部和腕部19處，肘窩18處，肘關節(jié)外側(cè)10處，腋窩6處，頸部7處，膝關節(jié)16處(腘窩12處)，踝部6處。供皮部位：大腿35例，背部6例，側(cè)胸部16例。將患者按照隨機數(shù)字表法分為聯(lián)合組(37例)和自體組(20例)，2組在性別比、年齡、原因、部位、受傷時間、嚴重分度、面積等方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。見表1。

表1 2組患者一般情況比較

1.2 治療方法

1.2.1 創(chuàng)面處理:手術區(qū)域0.5%碘伏消毒鋪巾，徹底去除壞死組織，深Ⅱ度創(chuàng)面削痂擴創(chuàng)至真皮深層，Ⅲ度創(chuàng)面擴創(chuàng)至深筋膜淺層，用雙極電凝徹底止血后，分別用3% H2O2溶液、0.1碘伏溶液、0.9%氯化鈉溶液依次沖洗創(chuàng)面2～3次。

1.2.2 聯(lián)合組的皮膚移植:①根據(jù)創(chuàng)面大小選用合適規(guī)格的lando雙層人工真皮修復材料，用無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3～5次后備用。將準備好的Lando雙層人工真皮修復材料平鋪于等待植皮的創(chuàng)面上，用4-0絲線縫合固定皮片邊緣。植皮區(qū)域依次用納米銀敷料、無菌碘伏紗布、無菌棉墊覆蓋，頸部植皮區(qū)域打包加壓固定，腋窩處創(chuàng)面打包加壓固定后外用石膏固定，其余部位植皮區(qū)域繃帶包扎固定后石膏固定。術后3 d 換藥1次，觀察真皮下有無瘀血，如無瘀血納米銀紗布包扎，如有瘀血給予清除后包扎。2周后去除雙層真皮外層硅膠膜，下面肉芽組織已形成，再次手術治療。②術中同前消毒，以手術刀輕刮肉芽創(chuàng)面至新鮮出血，再次同前沖洗創(chuàng)面，用電動皮刀在供皮區(qū)取大塊刃厚皮(厚度大約為0.25 mm)放入0.9%氯化鈉溶液中清洗3～5次備用，供皮區(qū)創(chuàng)面用慶大霉素鹽水紗布壓迫止血后立即外涂醫(yī)用生長因子凝膠，用納米銀敷料、無菌紗布包扎。將準備好的刃厚皮平鋪于等待植皮的創(chuàng)面上，用4-0絲線縫合固定皮片邊緣。植皮區(qū)域依次用納米銀敷料、無菌碘伏紗布、無菌棉墊覆蓋加壓包扎。1周后打開敷料，碘伏消毒后拆除縫線。

1.2.3 自體組皮片的移植:消毒，依創(chuàng)面情況用電動皮刀在供皮區(qū)切取皮膚的部分厚度或全層厚皮片，移植于創(chuàng)面。植皮區(qū)域依次用納米銀敷料、無菌碘伏紗布、無菌棉墊覆蓋加壓包扎。1周后打開敷料，碘伏消毒后拆除縫線。

1.3 觀察指標 隨訪觀察植皮區(qū)域皮膚顏色、外觀、質(zhì)地，與正常皮膚連接處的瘢痕增生情況，關節(jié)功能情況。于治療3、7、14 d取創(chuàng)面基底部組織，測定IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-12、VEGF、TGF-β1、P53、Bax、Caspase-3水平。將所取組織充分研碎，加入EGF中并充分勻漿，經(jīng)4℃ 3 000 r/min離心，選取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定。

2 結(jié)果

2.1 愈合情況 本研究患者共49例72處關鍵功能部位皮片均成活愈合好，皮片光滑柔軟，彈性好，其中聯(lián)合組35例50處，自體組14例22處。聯(lián)合組2例3個部位，自體組4例6個部位皮片邊緣有散在點狀壞死，經(jīng)換藥治療后7～14 d愈合。自體組1例1處移植皮片未成活，經(jīng)二次移植成活。2組治療效果差異有統(tǒng)計學意義(Fisher精確檢驗P=0.001)。

2.2 瘢痕形成及關節(jié)功能情況 治療后隨訪6～18(12.2±1.4)個月，聯(lián)合組植皮區(qū)一期愈合皮片無明顯增生攣縮的瘢痕，關節(jié)功能恢復接近正常水平，有輕微色素沉著；延遲愈合皮片有少許增生瘢痕，色澤外觀略差于正常愈合處皮膚，關節(jié)功能恢復相差不大。聯(lián)合組供皮區(qū)無明顯瘢痕，色澤接近正常皮膚。自體組8例供皮區(qū)出現(xiàn)較明顯瘢痕，2例4處植皮區(qū)有較明顯瘢痕生成。

2.3 創(chuàng)面細胞因子情況

2.3.1 創(chuàng)面炎性因子情況:術后2組創(chuàng)面中炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-12水平均逐漸下降，組間比較，術后3、7、14 d同一時間指標差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

項目3 d7 d14 dTNF-α 聯(lián)合組(n=37)3.52±0.382.76±0.322.34±0.33 自體組(n=20)3.47±0.402.69±0.352.38±0.30IFN-γ 聯(lián)合組(n=37)5.46±0.554.36±0.482.63±0.48 自體組(n=20)5.56±0.524.23±0.502.76±0.44IL-1 聯(lián)合組(n=37)6.92±0.784.49±0.663.89±0.53 自體組(n=20)6.54±0.834.85±0.573.75±0.58IL-12 聯(lián)合組(n=37)0.55±0.040.49±0.060.28±0.03 自體組(n=20)0.53±0.050.46±0.060.26±0.04

2.3.2 創(chuàng)面生長細胞因子情況:2組術后創(chuàng)面中生長細胞因子VEGF、TGF-β1呈逐漸升高趨勢，組間比較，術后3 d差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但術后7、14 d組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

項目3 d7 d14 dVEGF 聯(lián)合組(n=37)45.37±6.4858.46±10.25?80.53±12.41? 自體組(n=20)46.84±7.2266.26±10.3192.45±13.87TGF-β1 聯(lián)合組(n=37)20.36±6.2727.64±6.42?36.97±8.52? 自體組(n=20)22.41±6.4835.25±6.6945.75±8.23

注：與自體組比較,*P<0.05

2.3.3 創(chuàng)面凋亡基因表達情況:2組術后創(chuàng)面中P53、Bax、Caspase-3呈逐漸下降趨勢，組間比較，術后3、7、14 d同一時間指標組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

項目3 d7 d14 dP53(pg/ml) 聯(lián)合組(n=37)736.61±31.75492.42±25.28383.26±19.41 自體組(n=20)745.95±28.42503.67±24.85386.43±17.47Bax(ng/ml) 聯(lián)合組(n=37)52.25±6.3725.45±3.2020.64±2.63 自體組(n=20)54.16±6.4226.96±3.2421.26±2.54Caspase-3(ng/ml) 聯(lián)合組(n=37)24.78±2.7216.93±2.3311.36±1.64 自體組(n=20)22.85±2.6518.52±2.2312.53±1.77

3 討論

車禍、燒傷、難愈性潰瘍等是造成臨床皮膚損傷的常見原因，主要而有效的治療方法是皮膚移植、皮瓣組織擴張器等，治療效果理想。但是自體皮膚移植尤其是大面積移植，可能影響供皮區(qū)外觀，甚至功能。對于大面積皮膚創(chuàng)傷和對外形要求較高的群體，手術較難開展。并且由于存在一次手術無法使創(chuàng)面完全愈合的情況，可能增加手術次數(shù)，增加患者痛苦。人工真皮替代材料的出現(xiàn)改善了這種情況。人工真皮是一種由牛跟腱膠原與硫酸軟骨素交聯(lián)構(gòu)成的類真皮支架網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[10]，可以誘導成纖維細胞形成分布合理的新生膠原，促使毛細血管芽長入其中，從而提高再次移植的薄的斷層皮片的成活率，減少手術次數(shù)。并且移植后的皮片具備中厚植皮的特性，具有很強的彈性和耐磨抗壓性。動物及臨床實驗研究均證明，人工真皮可以幫助修復皮膚缺損，且有助于減少瘢痕的產(chǎn)生[11]。Lando人工真皮材料是由我國制造的，目前臨床相關研究較少，針對局部微觀變化的研究筆者尚未見報道。

皮膚創(chuàng)面修復中一個重要的病理變化是炎性反應，一定程度的炎性反應有助于加速創(chuàng)面的愈合[12]。巨噬細胞是在炎性反應過程中介導吞噬和抗原提呈的細胞類型[13]。IFN-γ、TNF-α等細胞因子可以誘導M1型巨噬細胞產(chǎn)生IL-1、IL-12等促炎因子，調(diào)節(jié)TH1細胞活性和TC細胞活性，介導炎癥級聯(lián)反應[14,15]，從而參與創(chuàng)面病原微生物的殺傷，促進創(chuàng)口愈合。本研究測定了2組患者在治療3 d、7 d、14 d時的炎性因子水平，總體均呈下降趨勢，但2組差異不顯著。這說明，人工真皮材料誘發(fā)創(chuàng)面炎性反應的能力與自體皮相當或創(chuàng)面炎性反應在人工真皮材料和自體皮膚移植的情況下水平相當，這與王桂芳等[9]的研究相符。可以推斷人工材料和機體相容性較高，誘發(fā)機體的免疫反應水平低，不容易產(chǎn)生炎性反應和免疫排斥。

VEGF和TGF-β1是促進創(chuàng)面愈合過程中成纖維細胞和上皮細胞增殖的因子[16，17]。VEGF可以促進血管內(nèi)皮生長，促進生成新血管，并且通過對基質(zhì)金屬蛋白酶表達的誘導改變細胞外基質(zhì)，促進新生血管的生長。還具有促進內(nèi)皮細胞增殖、移行的作用[18]。TGF-β1參與細胞增殖、分化，可以促進成纖維細胞增殖、增加創(chuàng)面膠原合成。但是兩者的過度表達，容易在創(chuàng)面愈合時形成瘢痕[19-21]。本研究中，自體組VEGF和TGF-β1表達顯著高于聯(lián)合組，可能是自體組瘢痕形成較多的原因。

創(chuàng)面修復的過程不僅與促生長因子的作用有關，修復所需內(nèi)皮細胞、上皮細胞和成纖維細胞的增殖還受凋亡分子的調(diào)控[22]。細胞內(nèi)調(diào)節(jié)凋亡的兩種機制為死亡受體凋亡途徑和線粒體凋亡途徑。線粒體凋亡途徑通過Bax來啟動下游Caspase所介導的級聯(lián)激活反應，Caspase-3是此級聯(lián)反應的最終激活因子，從而執(zhí)行細胞凋亡。P53是體內(nèi)多條凋亡途徑的調(diào)控分子,能夠通過阻礙細胞周期來抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡。對凋亡分子的分析證實，人工真皮對術后創(chuàng)面恢復過程中細胞凋亡表達的影響與自體皮比較沒有明顯差異，兩者促進創(chuàng)面的愈合的作用無明顯差異。

此外，聯(lián)合組愈合情況較自體組好，瘢痕形成較少。聯(lián)合組瘢痕形成較少，此結(jié)果與本研究中2組VEGF和TGF-β1水平的差異相符，低水平的促生長因子使得人工真皮材料組患者在修復過程中產(chǎn)生了更少的瘢痕，表面更加平整美觀。這一點使其容易被廣大患者接受，也更加適合對美容有特殊要求的群體，同時為其在美容行業(yè)的應用提供了基礎。

本研究中，Lando人工真皮植入2周時，新生毛細血管充分長入，真皮支架充分形成，具備移植自體刃厚皮片的條件，且移植效果良好，該結(jié)果與劉洋等[23]結(jié)果接近，有關動物實驗也顯示了同樣的研究結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn)人工真皮移植后第2天Fb即可侵入，并開始出現(xiàn)少量的中性粒細胞、淋巴細胞及巨噬細胞[24]。

人工真皮具有許多優(yōu)點，其在合并骨、肌腱外露創(chuàng)面的修復也有良好的治療效果，是較理想的真皮替代品，但是仍然存在一些問題：價格較高，部分患者會出于經(jīng)濟考慮，放棄使用；治療過程較為復雜，要經(jīng)過兩次手術，給患者帶來痛苦和心理負擔。生物材料缺乏抗感染能力，術后護理極為重要，要嚴密觀察，防止積液[25]，勤換藥，防止感染。

移植過程中，清創(chuàng)的徹底和創(chuàng)面的平整很重要，關系到術后皮片的存活狀態(tài)和是否感染。皮片的縫合注意保持一定的張力，但不能張力過大，有利于皮片成活、創(chuàng)面恢復且術后外觀較好。人工真皮的仿真皮交聯(lián)結(jié)構(gòu)在過大的壓力下有可能造成支架坍塌[26]，修復效果不理想，移植后加壓包扎應注意壓力適當。

本研究在微觀水平探討了應用人工修復材料創(chuàng)面的炎癥水平、再生因子及凋亡因子的表達情況，客觀評價了治療后的恢復情況。但研究存在以下問題：(1)納入人數(shù)較少，對于后期康復效果的比較難以以統(tǒng)計結(jié)果呈現(xiàn)，并且極易出現(xiàn)嚴重偏差，且小樣本的研究會造成一些結(jié)果難以呈現(xiàn)或被忽略。還有待臨床大樣本、多中心的研究進一步驗證。(2)對康復效果的評價多是肉眼觀察的結(jié)果，缺乏標準，難以在重復實驗中取得同樣結(jié)果。如能實現(xiàn)將瘢痕、色澤、點狀壞死等結(jié)果進行定量，則結(jié)果參考價值更高。(3)本研究對于不同的部位沒有進行分類探討，對嚴重的Ⅲ度燒傷，如肌肉缺失嚴重和骨裸露面積較大的燒傷，以及對手指關節(jié)處等對功能要求較高的，瘢痕和攣縮對預后影響較大的部位沒有針對性的研究。

綜上所述，國產(chǎn)Lando人工真皮在治療皮膚缺損創(chuàng)面的作用確切，具有促進創(chuàng)面愈合，減少瘢痕形成的作用，是理想的替代材料。