血清miR-9和miR-155表達在HPV陽性宮頸癌診斷和預后中的臨床價值

秦艷

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，其中人類乳頭瘤病毒(HPV)感染是發生宮頸上皮內瘤變(CIN)和宮頸癌的重要因素，其通過復雜的多階段和多基因突變等異常調控的過程[1]。在HPV感染的患者中發生CIN的風險為28%，而在10年內發生宮頸癌的幾率為3%。單一的HPV感染并不一定發展為宮頸癌，與機體的免疫和基因改變具有明顯的相關性[2]。微小RNA(miRNA)在腫瘤的發生發展過程中具有重要的作用，是一種非編碼小分子RNA，參與腫瘤的發生發展過程，對于診斷和預后判斷具有重要的臨床意義[3]。miR-9作為一個癌基因受到較高的關注，在多種腫瘤中具有診斷和預測腫瘤預后的功能，而其靶基因在宮頸癌的機制研究仍較少[4]。miR-155在多種惡性腫瘤發生發展具有重要作用，在不同腫瘤中可以表現為癌基因和抑癌基因的作用[5]。本組研究通過聯合血清miR-9和miR-155表達在HPV陽性宮頸癌表達，觀察其在宮頸癌患者早期診斷和預測預后的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015至2017年在我院診治的HPV陽性的宮頸癌患者119例，為宮頸癌組，年齡35～60歲，平均年齡(43.65±9.16)歲；體重指數(BMI)(22.38±3.15)kg/m2；病理分型：鱗癌106例，腺癌13例；分化程度：高分化10例，中分化98例，低分化11例；臨床分期：Ⅰ期45例，Ⅱ期54例，Ⅲ期12例，Ⅳ期8例；淋巴結有轉移21例，無轉移98例。選擇同期在我院HPV陽性子宮內瘤變的患者75例，為CIN組，年齡35～60歲，平均年齡(42.93±8.46)歲；BMI(22.38±3.15)kg/m2；選擇同期在我院就診HPV陽性良性宮頸病變或者單純HPV陽性者45例為對照組，年齡35～60歲，平均年齡(43.67±8.69)歲；BMI(21.96±3.27)kg/m2。3組在年齡和BMI方面差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：宮頸癌組，CIN組和對照組均HPV陽性，并且符合相關的診斷標準；均知情同意簽字，經醫院倫理委員會通過。

1.2.2 排除標準：合并其他腫瘤；合并血液性和免疫性疾??；參與其他臨床實驗者；接受放療，化療和生物治療的患者。

1.3 方法

1.3.1 血液標本采集：患者入院后清晨空腹肘靜脈血約10 ml，在4℃的條件下放置30 min，低速離心20 min，離心速度1 800 r/min，離心半徑為15 cm，離心后去上清液，將其保存在-70℃冰箱中保存。

1.3.2 miRNA提取和逆轉錄反應：根據miRNeasy提取試劑盒的說明書提取miRNA，并通過紫外分光度將吸光度的比值在1.8～2.0的標本保存用于后續檢測，保存在-70℃的冰箱中。按照miRNA反轉錄試劑盒的使用說明書將miRNA反轉錄為cDNA，標本保存在-70℃的冰箱中。

1.3.3 qRT-PCR檢測：根據GenBank中的miR-9，miR-155和U6的序列號，并用Premier Primer5.0軟件進行引物設計，并由蘇州金唯智生物科技有限公司合成引物。miR-9引物序列，上游：5’-ACACTCCAGCTGGGTCTTTGGT-3’,下游：5’-CTCAACTGGTGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCATACAG-3’，miR-155的引物序列，上游：5’-CCCTCGAGAGCTCCTTCCTTTCAACAG-3’,下游：5’-CCAAGCTTCCCAGTGACCAGATTATGA-3’和U6引物序列，上游：ATCCGCAAAGACCTGT，下游：GGGTGTAACACTAAG。qRT-PCR的總反應體系為25 μl，包括上下游引物各1.0 μl(濃度10 μmmol/L)，cDNA為0.8 μl，RNase H2O為12.2 μl和SYBRPPrimix Ex TaqTM 10 ml。反應條件為：預變性溫度95℃10 min，95℃和60℃分為5 s和60s，總共進行40個循環。在60℃用ABI7700軟件收集熒光信號進行溶解曲線分析，每個樣品進行3個平行復孔，相對表達量采用表示2-ΔΔCt，公式表達為ΔΔCt=試驗組(Ct目標基因-CtU6)-對照組(Ct目標基因-CtU6)。

1.3.4 觀察指標：比較宮頸癌組，CIN組和對照組血清miR-9和miR-155表達量，觀察宮頸癌患者血清miR-9和miR-155表達與臨床指標和診斷宮頸癌的臨床價值，比較血清miR-9和miR-155表達水平與宮頸癌死亡的關系及評價死亡的臨床價值。

2 結果

2.1 3組血清miR-9和miR-155表達比較 宮頸癌組的血清miR-9和miR-155表達明顯高于CIN組和對照組(P<0.01)，而CIN組的表達水平明顯高于對照組(P<0.01)。見表1。

組別MiR-9(2-ΔΔCt)MiR-155(2-ΔΔCt)宮頸癌組(n=119)6.30±1.90?#16.51±5.01?#CIN組(n=75) 4.01±1.22?10.31±4.10?對照組(n=45) 2.36±0.976.71±2.38F值134.176115.280P值0.0000.000

注：與對照組比較，*P<0.01；與CIN組比較，#P<0.01

2.2 血清miR-9和miR-155表達與宮頸癌患者臨床指標的關系 宮頸癌患者血清miR-9和miR-155表達與年齡，病理分型，分化程度和腫瘤直徑無明顯相關性(P>0.05)，而與臨床分期，淋巴轉移，間質浸潤深度，累及陰道壁，累及宮旁組織和累及血管間隙具有明顯相關性(P<0.01)。見表2。

2.3 宮頸癌患者血清miR-9和miR-155表達在診斷宮頸癌的診斷效能 血清miR-9和miR-155表達水平在診斷宮頸癌方面具有較高的靈敏度和特異性，將上述兩指標是否為宮頸癌通過二元回歸分析，聯合指標(miR-9+miR-155)具有明顯的線性關系，得回歸方程0.951XmiR-9+0.391XmiR-155-9.260，并發現聯合檢測的曲線下面積為0.909，靈敏度為82.4%，特異度82.7%，在診斷宮頸癌方面明顯優于單獨miR-9(Z=2.864，P=0.004)和miR-155(Z=4.156，P=0.000)，而兩個指標之間的曲線下面積差異無統計學意義(P>0.05)。見表3，圖1。

臨床指標miR-9(2-ΔΔCt)t(F)值P值miR-155(2-ΔΔCt)t(F)值P值年齡(歲)0.2430.8080.5360.593 <45(n=56)6.34±1.86 16.75±4.35 ≥45(n=63)6.26±1.73 16.30±4.76 病理分型0.1820.8560.1960.845 鱗癌(n=106)6.29±1.68 16.48±4.68 腺癌(n=13)6.38±1.75 16.75±4.73 臨床分期3.7740.00010.8530.000 Ⅰ～Ⅱ期(n=99)6.05±1.58 14.35±4.86 Ⅲ～Ⅳ期(n=20)7.54±1.76 27.20±4.67 分化程度0.5360.5640.1850.790 高(n=10)6.28±1.68 15.86±4.76 中(n=98)6.34±1.56 16.51±4.57 低(n=11)5.96±1.75 17.10±4.52 腫瘤直徑(cm)0.5120.6091.3420.182 >4(n=53)6.39±1.71 15.86±4.82 ≤4(n=66)6.23±1.68 17.03±4.65 淋巴結轉移4.5840.0003.3920.001 是(n=21)7.88±1.65 19.73±4.86 否(n=98)5.96±1.76 15.82±4.78 間質浸潤深度5.1580.0003.0700.003 <2/3(n=72)5.68±1.55 15.43±4.66 ≥2/3(n=47)7.25±1.73 18.17±4.91 累及陰道壁5.6820.0002.8980.005 有(n=21)8.07±1.77 19.25±4.82 無(n=98)5.92±1.53 15.92±4.77 累及宮旁組織6.6990.0004.0660.000 有(n=13)9.16±1.72 21.52±4.65 無(n=106)5.95±1.62 15.90±4.71 累及血管間隙8.8770.0004.8000.000 有(n=37)8.35±1.71 19.57±4.76 無(n=82)5.38±1.68 15.13±4.63

表3 聯合血清miR-9和miR-155表達在診斷宮頸癌的效能

2.4 宮頸癌患者血清miR-9和miR-155表達與預后的關系 宮頸癌死亡組血清miR-9和miR-155表達水平明顯高于生存組(P<0.01)。見表4。

2.5 血清miR-9和miR-155表達水平在預測死亡的效能 血清miR-9和miR-155表達水平在預測宮頸癌死亡方面具有較高的靈敏度和特異性，將兩個指標是

圖1 聯合血清miR-9和miR-155表達在診斷宮頸癌的曲線下面積

組別miR-9(2-ΔΔCt)miR-155(2-ΔΔCt)生存組(n=86)5.60±1.5014.58±3.83死亡組(n=33)8.12±1.6221.53±4.22t值8.0248.613P值0.0000.000

否為宮頸癌通過二元回歸分析，聯合指標(miR-9+miR-155)具有明顯的線性關系，得回歸方程1.042XmiR-9+0.440XmiR-155-16.027，并發現聯合檢測的曲線下面積為0.958，靈敏度為97.0%，特異度87.2%，在預測死亡方面明顯優于單獨miR-9(Z=2.376，P=0.018)和miR-155(Z=2.048，P=0.041)，而兩個指標之間的曲線下面積差異無統計學意義(P>0.05)。見表5，圖2。

表5 聯合血清miR-9和miR-155表達水平在預測死亡的效能

圖2聯合血清miR-9和miR-155表達水平在預測死亡的曲線下面積

3 討論

miRNAs是基因調控網絡中的重要組成部分，參與多種信號通路的進行調控?，F有研究表明，miRNAs參與了腫瘤細胞的增殖，遷移，分化和凋亡等過程[6]。研究顯示，在宮頸癌發病過程中，具有多種miRNAs異常表達，并且認為miRNAs可能參與了宮頸癌的發生發展過程，尤其在早期診斷宮頸癌，改善預后方面具有較高的臨床價值[7]。miRNAs可以在穩定和豐富的形式存在于體液中，如果以血液作為載體對腫瘤進行檢測，不僅可以擺脫對原發組織的依賴，而且為腫瘤的早期診斷提供一條無創，便捷的新途徑。

本組研究證實表明宮頸癌患者血清miR-9表達水平明顯高于CIN組和對照組，與文獻報道宮頸癌患者出現miR-9高表達一致，并且發現血清miR-9表達水平在診斷宮頸癌診斷中具有較高的特異性，當血清相對表達>4.971時，其靈敏度為75.6%，特異性為81.3%，曲線下面積為0.485，說明血清miR-9表達水平對診斷宮頸癌具有一定的參考價值。本組研究還發現宮頸癌患者血清miR-9表達與與臨床分期，淋巴轉移，間質浸潤深度，累及陰道壁，累及宮旁組織和累及血管間隙具有明顯相關性(P<0.05)，說明血清miR-9表達一定程度反映宮頸癌患者的惡性程度，是反映宮頸癌預后的指標?，F已知miR-9在多種惡性腫瘤中出現異常表達，在乳腺癌膽管癌，肝癌和直腸癌呈高表達，而在胃癌，卵巢癌和腎細胞癌為低表達[8]。在一項對宮頸癌的研究中，利用芯片技術對宮頸癌組織檢測發現出現15個miRNAs上調和10 miRNAs下調，而miR-9在宮頸癌組織中出現明顯上調[4]。在一項miR-9對腫瘤細胞信號轉導通路影響的研究發現miR-9能夠調節肌動蛋白骨架，細胞黏附信號和脂質代謝等重要過程具有密切聯系[9]。本組研究還發現宮頸癌患者死亡組血清miR-9表達明顯高于生存組，并且發現宮頸癌患者血清miR-9表達在預測死亡方面具有較高的特異性和靈敏度，說明血清miR-9表達是宮頸癌預后的重要指標，與文獻報道[10]miR-9與宮頸癌預后具有密切相關。

本組研究表明宮頸癌患者血清miR-155表達明顯高于CIN組和對照組，并且發現其在診斷宮頸癌效能方面具有較高的靈敏度和特異性，與文獻報道miR-155基因相當于癌基因作用，其定位于21q21.3，參與腫瘤增殖和遷移的關鍵關節之一，在乳腺癌和胰腺癌等腫瘤細胞的生長，增殖，免疫逃逸和化療耐藥具有重要作用[11]。本組研究發現宮頸癌患者血清miR-155表達與臨床分期，淋巴轉移，間質浸潤深度，累及陰道壁，累及宮旁組織和累及血管間隙具有明顯相關性(P<0.05)，說明miR-155的表達預測宮頸癌惡性程度具有重要作用。在一項宮頸癌患者血清miR-155表達水平在診斷宮頸癌效能方面明顯優于傳統的指標如CA125和鱗狀細胞癌抗原，具有較高的特異性，認為作為鑒別HPV陽性宮頸癌和CIN方面具有重要的臨床價值，并認為可以作為監測宮頸癌發生發展和診斷HPV陽性宮頸癌的重要標記物[12]。miR-155基因在不同腫瘤中具有不同的作用，miR-155基因在乳腺癌中具有明顯抑制增殖和轉移，作為抑癌基因[13,14]；而在肺癌的形成過程中具有促進作用，并在腫瘤的轉移過程中具有決定性作用[15,16]。本組研究還發現宮頸癌死亡組患者血清miR-155表達明顯高于生存組(P<0.05)，并發現血清miR-155在預測宮頸癌死亡方面具有較高的特異性和靈敏度，是宮頸癌預后的重要基因。本組研究發現聯合檢測宮頸癌血清miR-9和miR-155表達在診斷宮頸癌較高的特異性和靈敏度，并且發現其曲線面積明顯高于單個基因miR-9和miR-155的診斷效能，說明聯合檢測在提高診斷效能方面具有重要價值。在預測宮頸癌死亡方面，聯合檢測宮頸癌患者血清miR-9和miR-155表達具有更高的靈敏度和特異性，其曲線下面積明顯優于單個基因表達，能夠提高預測預后不良的效能。