過氧化物酶體增殖物激活受體γ多態性與結直腸癌風險的相關性分析

張智 王璇 劉群 許麗玲

結直腸癌(CRC)是發達國家中發病率最高的癌癥之一。西方發病率高、亞洲發病率低的地理格局表明，除了遺傳決定因素外，生活方式和飲食因素可能是結腸癌發生的重要因素[1]。其中，肥胖癥在西方人群中更為普遍，在病例控制和隊列研究中，肥胖一直與男性和女性中較高的CRC風險相關[2]。隨著越來越多的實驗證據，這些流行病學數據表明肥胖引起的高胰島素血癥，高脂血癥和胰島素抵抗可能在結腸癌的發生中起作用[3]。作為一種核受體，它在調節脂肪細胞分化、葡萄糖和脂質穩態以及細胞內胰島素信號事件中起著關鍵作用，過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)g因其在CRC中的作用而受到越來越多的關注[4]。PPARγ的內源性配體包括多不飽和脂肪酸(PUFA)和花生四烯酸衍生物。實驗證據表明，PPARγ在結腸中的激活導致了生長抑制和分化，降低了CRC細胞的惡性潛能[4,5]。此外，PPARγ配體曲格列酮對化學誘導的大鼠結腸炎和異常隱窩形成有明顯的抑制作用。PPARγ基因通過差異啟動子和選擇性剪接產生四種不同的PPARγ mRNA，形成兩種不同的蛋白質亞型[6]。PPARγ 1、PPARγ3和PPARγ 4轉錄本雖然具有不同的上游調控序列，但產生了由外顯子1-6編碼的相同蛋白質。PPARγ3轉錄本啟動子區的功能C-to-G多態性681從a2外顯子一開始就與體重增加和循環膽固醇水平有關。PPARγ2轉錄本產生一種由PPARγ2特異性外顯子B編碼的額外28個氨基酸的蛋白質。第B外顯子的脯氨酸-丙氨酸替換密碼子12的多態性與糖尿病和CRC的風險降低有關。研究對PPARγ2編碼區和PPARγ3調控區的這兩個多態性與CRC風險的關系進行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 在2016年1月至2019年1月共有100名年齡45～74歲的中國男女人士加入這項研究。用一份結構化的問卷，要求了解過去一年的人口統計、終生使用煙草和乙醇、病史、癌癥家族史和日常飲食方面的信息。評審委員會已經批準了這項研究。我們收集了100名受試者的血/頰細胞樣本。在2003年5月31日前，排除了18名在招募時有CRC病史(N5)或第一次CRC(N13)的受試者，另外招募100名受試者構成本研究的參照(即對照)組。與其他隊列成員相比，這些受試者在年齡、性別、方言組、受教育程度、體重指數、飲酒史、糖尿病史或CRC或任何癌癥的家族史上有相似的分布(P>0.10)。對照組吸煙者的比例(27.8%)略低于其他隊列參與者(31.6%，P=0.04)。

1.2 基因分型方法 用QIAamp 96 DNA試劑盒(QIAGEN，Valencia，ca)從外周血和口腔細胞樣本中提取DNA。

1.2.1 PPARγ2 Pro12Ala多態性測定：通過多態區的直接測序，鑒定了PPARγ2 Pro12Ala多態性(rs1801282)的等位基因。用引物GC083對(5’-GGAACTGATGTCTTGACTCATG-3’)和GC083rev(5’-GCAGAGAGAGTTATCAGAGAGAGAGG-3’)進行PCR擴增。PCR反應用熱啟動Taq聚合酶(QIAGEN，巴倫西亞，ca)根據制造商的指示，使用20 ng的基因組DNA，2 mmol/L的MgCl2和300 μm的每個引物。在熱循環(MWG Biotech，High Point，NC)上進行PCR擴增，初步步驟為95℃，15 min，35次周期，每25秒95℃，54℃/min，72℃/min。用MAF-nob PCR純化板(Milli孔隙、Billerica、MA)對PCR反應進行純化，去除dNTPs和引物。部分樣品經瓊脂糖凝膠電泳分析，證實PCR反應成功，陰性對照無產物。用引物GC083S(5’-ACTGATGTCTTGACTCATGGGTG-3’)進行DNA測序，用熒光標記的DDNTPS(ABI染料終止子測序試劑盒，應用生物系統)進行10～20 ng純化PCR產物的循環測序，每15秒進行95℃，每3.5分鐘進行50℃的循環測序。測序反應在abi3730xl毛細管DNA分析儀上進行。序列文件通過PHRED/PHRAPP(華盛頓大學)對序列進行比對，并標記可能的多態位置。在CONSED(華盛頓大學)中觀察序列和多態位置評分。

1.2.2 PPARγ3C-681G多態性(Rs10865710測定：用熒光5’核酸酶分析(Taqman法)進行基因分型。TaqMan檢測是根據制造商的指示使用TaqMan PCR核心試劑盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)進行的。擴增PPARγ3多態區的引物為GC028(5’-CCTGATGATAAGGCTTGTTGTTGT-3’)和GC028rev(5’-ATCTTATGAATAGTCAAGGATCCT-3’)。此外，用于檢測每個等位基因的熒光寡核苷酸探針(TaqMan MGB；ABI)是用6 FAM標記的GC028F(5’-TTTTCCATCAAGACAAAA-3’)標記的，用Vic標記的GC028V(5’-TTTTCCATGAAGACAAAA-3’)檢測G等位基因。采用PCR擴增技術，在熱循環中進行10 ng的基因組DNA擴增，起始時間為95℃，10 min，95℃周期為50次，周期為25 s，60℃周期為1 min。在ABI7900HT序列檢測系統中對每口井的熒光剖面進行了測量，并用序列檢測軟件(應用生物系統)對結果進行了分析。實驗樣本與12名對照進行比較，分別在每個位點(G/G、G/C、C/C)鑒定3種基因型。在對照組定義的參數之外的樣本被識別為非信息，并被重新測試。

1.3 統計學分析 應用SAS 9.1統計軟件，采用精確試驗對正常人的基因進行Hardy Weiberg平衡檢查，采用χ2檢驗，以優勢比(OR)及其95%置信區間(CIS)和P值來衡量某一特定基因-癌癥關聯的強度，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組人群中CRC人口特征及潛在危險因素分析 100例中，57例為結腸癌，43例為直腸或直腸乙狀結腸癌。診斷時患者平均年齡66.1歲。基線訪談與癌癥診斷的時間間隔1個月～9.9年。與對照組相比，病例患者在招募時年齡較大，男性比例較高，受教育程度較低，BMI較高，更有可能吸煙和每天飲酒。更有可能有糖尿病病史，更有可能與CRC有一級親屬關系。見表1。

2.2 PPARγ rs10865710多態性與CRC風險的關系 對照組PPARγ2多態性的C、G等位基因頻率分別為0.961和0.039，PPARγ3多態性的C等位基因和G等位基因頻率分別為0.634和0.366。所有基因型分布處于Hardy Weinberg平衡(P>0.7)。PPARγ2 Pro12Ala和PPARγ3C-681G多態性位點等位基因相關的R2為0.07，表明缺乏LD。見表2、3。

表1 研究人群中CRC的人口特征和潛在危險因素的分布 n=100，例

注：*輕度吸煙者是指15歲開始吸煙或每天吸煙<13支的人，而重度吸煙者是15歲前開始吸煙和每天吸煙≥13支的人

2.3 CRC危險因素中PPARγ多態性的單倍型頻率與病例控制狀態及優勢比(OR)的關系 PPARγ2和PPARγ3基因型與CRC風險的關系。在PPARγ2基因多態性上，由于GG基因型頻率較低，對GG和GG基因型進行了分組。具有至少一個G等位基因拷貝的受試者患CRC的風險降低50%(或0.53，95%CI 0.30～0.92)。就PPARγ3多態性而言，具有至少一個C等位基因拷貝的受試者與G等位基因純合者相比，CRC風險降低了25%以上。擁有兩個C等位基因副本并不意味著任何額外的風險降低。因此，PPARγ2，CG/GG基因型和PPARγ3 GC/CC基因型被認為是CRC的低危險基因型。當同時檢測PPARγ2和PPARγ3基因多態性時，只有一個低危險基因型者的OR值(95%)為0.72(0.49～1.07)，而具有兩種低危險基因型者的OR值為0.19(0.07～0.51)，與無低危險基因型者相比(P=0.25)。在任何基因風險關聯的不同亞位點(即結腸和直腸癌)沒有明顯的差異。見表4。

2.4 癌旁非癌組織基因型與組織學評分的關系 我們還研究了PPARγ2和PPARγ3基因型在非糖尿患者群中與CRC發病的關系。在排除那些在招募時報告有醫生診斷的糖尿病病史的受試者后，只有一種基因型和兩種低風險基因型的患者的OR(95%順鉑)分別為0.66(0.43～1.01)和0.16(0.05～0.41)，兩種PPARγ基因多態性與無低風險基因型比較(P=0.0001)。我們還按年齡(<60歲和≥60歲)、性別、體重指數(<24 kg/m2和≥24 kg/m2)、吸煙(NO/YES)、飲酒(NO/YES)和CRC家族史(NO/YES)進行分組分析。PPARγ2和PPARγ3的聯合基因型與CRC風險之間的負相關關系在任何分層變量的亞組之間具有可比性(數據未顯示)。見表5。

表2 PPARγ rs10865710多態性與CRC風險的關系

注：*除了登記日期和禁食狀態的匹配因素外，再根據登記年齡、腰圍和雌激素關鍵暴露時間對OR進行進一步調整

表3 PPARγ rs1801282多態性與CRC風險的關系

注：*除了登記日期和禁食狀態的匹配因素外，再根據登記年齡、腰圍和雌激素關鍵暴露時間對OR進行進一步調整

表4 CRC危險因素中PPARγ多態性的單倍型頻率與病例控制狀態及優勢比(OR)的關系

注：*單倍型由PPAR-681C>G，Pro12Ala，1431C

基因型(n)Pro/Pro(130)Pro/Ala(21)P值嗜中性白血球浸潤0.85±0.461.00±0.320.14單核細胞浸潤1.65±0.620.90±0.640.10萎縮1.09±0.761.40±0.820.09腸上皮化生1.42±1.031.85±0.460.08

3 討論

在這個群體中，我們報告了PPARγ2 Pro12Ala和PPARγ3 C-681G基因多態性對CRC風險的影響。盡管與PPARγ2變異體相關的風險降低與報告的西班牙人群中的CRC和美國人群中的大腸腺瘤相似[7]，但這是第一次將PPARγ3基因多態性與CRC風險相關的研究。

本研究中PPARγ2基因多態性為C-to-G錯義突變，導致PPARγ2特異外顯子B密碼子12處脯氨酸(proline，PRO)取代丙氨酸(Ala)。這種替代是在蛋白質的一個區域內，它增強了不依賴配體的激活[8]。據報道，該變異的等位基因頻率在不同人群中存在差異，從白人為0.12[9]，墨西哥裔美國人為0.10[10]，非裔美國人為0.03，中國大陸華人為0.01[11]。我們的Ala等位基因頻率在中國人群中為0.039，與以前報道的新加坡華人的頻率一致。我們發現這兩個多態位點之間缺乏較強的LD，這與HapMap數據是一致的[12]。HapMap數據顯示，漢族和高加索人的R2值分別為0.08和0.31。與R2相比，Lewontin在我們的數據集(1.0，95%CI=0.92～1.0)和HapMap數據集(95%CI=0.11～0.99)中的D’值較高；1.0%，95%CI=0.69～1.0(歐洲白人)，表明LD高。然而，在低等位基因頻率的情況下，例如PPARγ2的情況(在我們的研究人群中為0.039；在HapMap白人中為0.075)，D’可能無效，因為它可以被極大地膨脹。因此，在我們的研究中，我們認為使用R2而不是D’更合適，而在我們的研究中R2的低值表明我們缺乏LD[13]。一項西班牙參與者的病例對照研究發現，帶有G等位基因的受試者的CRC風險降低了45%，這與我們在研究中注意到的降低風險的程度相似[14]。這些經驗數據表明，推測的低風險G等位基因可能與生物學上較高的PPARγ2活性有關[15]。

雖然PPARγ2和PPARγ3亞型均在脂肪組織中表達，但PPARγ蛋白在正常結腸上皮細胞和腫瘤性結腸上皮細胞中的表達主要是γ3亞型。PPARγ3 mRNA在人結腸癌細胞系中的分布在基礎條件下比G2同工型多100倍，在誘導分化的G2上增加了600倍以上[16]。PPARγ激動劑對體外培養的人CRC細胞的生長抑制作用與G1期阻滯、多種分化標志和細胞凋亡有關。此外，PPARγ配體通過抑制核因子-kappa B的激活，顯著降低結腸癌細胞中細胞因子基因的表達，提示PPARγ3可能在調節腸道炎性反應中起重要作用[17]。對人CRC細胞的檢測顯示，55名無關個體的7%的腫瘤中PPARγ基因出現了功能缺失突變。這些實驗研究為PPARγ3在大腸癌中的抑癌作用提供了證據[18]。

綜上所述，PPARG在CRC中的作用。這些發現可能具有臨床意義。其中一種可能針對藥物開發中的PPARG激活途徑，作為CRC預防和治療策略的一部分。