Aβ1-42誘導的老年性癡呆大鼠血清中miR-221表達與認知功能的關系

孫永 孫輝 姚凱華 李志鋒 李永文

作為一種常見的中樞神經系統退行性疾病，阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又被稱為老年性癡呆，其臨床特征主要表現為進行性記憶障礙、認知功能障礙、行為失常及人格改變[1-3]。細胞間淀粉樣斑塊及大量的神經原纖維纏結是該病的主要病理學特征[4]。環境、遺傳等被認為是導致發病的重要因素，淀粉樣級聯假說認為β-淀粉樣蛋白聚集于細胞外形成纖維狀，進一步發展為老年斑，引起局部組織發生炎癥甚至導致神經細胞凋亡，但目前關于其發病機制仍未有明確定論[5,6]。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一類非編碼的可調控基因表達的小分子RNA，在血清、乳汁、唾液及尿液等中均被檢測到[7,8]。近年來，諸多研究表明miRNA與腫瘤、神經退行性疾病等多種疾病相關，血清中miRNA的種類和水平可用于反應疾病的類型、進展及機體的生理狀況[9,10]。關于老年性癡呆患者血清中miR-221水平與認知功能的關系尚未見報道，因此本研究采用淀粉樣蛋白(Aβ1-42)誘導AD大鼠模型，以探討大鼠模型血清中miR-221的表達水平與認知功能的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞株及主要試劑 8～12周齡SPF 級健康雄性Sprague—Dawley(SD) 大鼠[合格證號：SYXK(京)2013-0032]60只，體重200～300 g/只，于北京維通利華實驗動物技術有限公司采購，將大鼠隨機分籠，于60%～70%濕度、21℃～26℃室溫下適應性飼養1周，期間讓其自由飲水飲食。Aβl-42購自北京中杉金橋，使用前將其用無菌0.9%氯化鈉溶液稀釋至10 μg/μl，置于37℃作用1周，使其成聚集態。熒光定量PCR試劑盒及Trizol均購自為TAKARA公司。jet PRIME購自美國polyplus公司。miR-221過表達慢病毒及miR-221空載體對照由上海吉凱設計并構建。兔多克隆抗體to BACE1(Anti-BACE1抗體，ab2077)購自Abcam。

1.2 大鼠建模 將60只大鼠隨機分為Aβ1-42誘導的AD組、AD+miR-221過表達組、AD+空載體組及正常對照組，每組15只。Aβ1-42誘導的AD方法：采用腹腔注射10% 水合氯醛(30 mg/kg)的方法麻醉大鼠，用腦立體定位儀(日本NARISHIGE型)將大鼠頭部固定，頭頂部去毛，碘伏棉球消毒手術區，取顱頂中部作小縱切口使顱骨暴露，首先定位前囟并于其中線處旁開，向后、向下各3.0 mm，用1 mm牙科鉆于顱骨上打兩個對稱孔，作為海馬區注射點。將硬腦膜用針挑破，雙側海馬區各注射10 μg Aβ1-42，為使溶液充分彌散，注射時間控制在10 min，之后留針10 min，撤針時需緩慢。針孔用牙托粉填補，同時為防止傷口感染可使用慶大霉素，將皮膚縫合并再次消毒。術后大鼠完全清醒前進行單籠飼養。AD+miR-221過表達組、AD+miR-221空載體組分別于AD大鼠尾靜脈注射miR-221慢病毒質粒及空載體質粒，正常對照組不進行任何處理。

1.3 RT-qPCR檢測4組大鼠血清中miR-221水平 各組大鼠建模完成后1周，采用斷尾采血的方式收集大鼠血液，離心，分離血清，-80℃保存備用。用Trizol法提取總RNA并反轉錄為cDNA，以得到的該cDNA為模板進行熒光定量PCR，檢測血清中miR-221的表達水平。同時以U6作為內參基因。每個樣本均進行3次重復實驗。

1.4 水迷宮實驗 4組大鼠建模完成后7 d進行水迷宮實驗，定位航行實驗訓練連續進行4 d，4次/d，分別取不同象限的固定位置作為入水點，保持25～28℃的水溫，將大鼠放入水中時面向水池壁，大鼠入水到其找到平臺的時間作為逃避潛伏期。若大鼠入水2 min內未找到平臺則輕輕將其拖上平臺休息30 s，若大鼠自行在2 min內找到平臺，則讓其在平臺上休息30 s。從4個入水點將大鼠分別放入水池即為1次訓練，計算機全程跟蹤各大鼠訓練過程，游泳距離取4次總行程的平均值，計算逃避潛伏期。以第5天的成績平均值作為最終實驗結果。

1.5 海馬區和大腦皮質神經元毒性檢測 大鼠建模完成后存活8周，以腹腔注射10%水合氯醛(0.35 g/kg)的方式將其麻醉，然后依次用0.9%氯化鈉溶液200 ml、含5%戊二醛的1%多聚甲醛400 ml進行灌流固定，取出大鼠海馬及大腦皮質，冷凍切片后采用丙酮固定，最后經常規HE染色后觀察。

1.6 Western-blot檢測大腦組織中BACE1蛋白 大鼠建模完成后存活8周，取大鼠大腦組織，用動物細胞/組織總蛋白提取試劑盒，提取組織總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。制備蛋白樣品，并進行SDS-PAGE凝膠電泳后轉至PVDF膜，加含有5%BSA的封閉液室溫下孵育2 h，加入用封閉液稀釋的Anti-BACE1抗體，4℃冰箱過夜孵育。次日取出復溫后，PBST洗膜3次，每次10 min，再加稀釋好的HRP標記的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h，PBST洗膜，加ECL進行顯色，暗室曝光拍照，同時以GAPDH作為內參蛋白。

2 結果

2.1 4組大鼠血清中miR-221的表達水平 采用RT-qPCR檢測4組大鼠血清中miR-221表達水平，以U6作為內參基因，以正常對照組作為標準，AD組、AD+空載體組及AD+miR-221過表達組中miR-221水平均顯著低于對照組(P<0.05)，AD+miR-221過表達組高于AD組、AD+空載體組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1，圖1。

組別miR-221表達水平正常對照組1.05±0.13AD組0.57±0.08?#AD+空載組0.59±0.09?#AD+過表達組0.77±0.11?

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與AD+過表達組比較，#P<0.05

圖1RT-qPCR檢測4組大鼠血清中miR-221表達水平;與正常對照組比較，*P<0.05；與AD組、AD+空載體組比較，#P<0.05

2.2 4組大鼠的認知功能 水迷宮實驗檢測4組大鼠的認知功能，結果顯示，與正常對照組比較，AD組、AD+空載體組及AD+miR-221過表達組大鼠逃避潛伏期顯著延長(P<0.05)；AD+miR-221過表達組與AD組、AD+空載體組比較，大鼠逃避潛伏期明顯縮短，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2，圖2。

組別逃避潛伏期正常對照組10.19±0.89AD組27.38±2.12?#AD+空載組27.51±2.09?#AD+過表達組14.71±1.91?

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與AD+過表達組比較，#P<0.05

圖2水迷宮實驗檢測4組大鼠的認知功能;與正常對照組比較，*P<0.05；與AD組、AD+空載體組比較，#P<0.05

2.3 4組大鼠海馬區神經元毒性檢測結果 HE染色后顯微鏡下觀察，正常對照組大鼠海馬區CAI區保持完整結構，神經元具有正常形態，整齊排列并且均勻分布。AD組大鼠海馬區神經元損傷嚴重，CAI區錐體細胞數量減少，體積變小，排列紊亂，胞質呈淡紅色，胞核大量固縮且呈藍黑色。AD+空載體組與AD組相近。AD+過表達組相比AD組和AD+空載體組改善顯著。見圖3。

圖3 4組大鼠海馬區的形態學變化(HE染色×400);A 正常對照組;B AD組;C AD+空載體組;D AD+過表達組

2.4 4組大鼠大腦皮質神經元毒性檢測結果 正常對照組大腦皮質神經元緊密規則排列，細胞核位于細胞中央，染色淺、大而圓，未見損傷。AD組大腦皮質區神經元大量凋亡，體積變小，胞質呈淡紅色，嗜酸性增強，胞核固縮，呈藍黑色，染色質呈團塊狀。AD+空載體組與AD組相近。AD+過表達組與AD組和AD+空載體組比較顯著改善，趨向于正常對照組。見圖4。

2.5 大腦組織中BACE1蛋白表達 Western-blot檢測結果顯示，與正常對照組比較，AD組和AD+空載體組大腦組織中BACEl蛋白表達量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；AD組和AD+空載體組差異無統計學意義(P>0.05)；AD+過表達組顯著低于AD組和AD+空載體組(P<0.05)，高于正常對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3，圖5。

圖44組大鼠大腦皮質區的形態學變化(HE染色×400);A 正常對照組;B AD組;C AD+空載體組;D AD+過表達組

組別BACEI/GAPDH正常對照組0.32±0.09AD組0.95±0.19?AD+空載組0.92±0.18?AD+過表達組0.46±0.12?#

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與AD組、AD+空載體組比較，#P<0.05

圖5Western-blot檢測大鼠大腦組織中BACE1蛋白;與正常對照組比較，*P<0.05;與AD+過表達組比較，#P<0.05

3 討論

作為老年性癡呆患者腦內老年斑的主要成分，含有39～43個氨基酸多肽的β-淀粉樣蛋白(Aβ)，由淀粉樣前體蛋白(APP)水解產生后又因機體代謝障礙而于海馬、基底核等部位沉積，可使神經纖維纏結，從而誘導神經元產生退行性病變以及學習記憶障礙[11-13]，因此Aβ可用于建立AD動物模型。微小RNA(microRNA，miRNA)屬于內源性非編碼小RNA，約包含21～23個堿基，其單鏈 RNA 前體約70～90個堿基且具有發夾結構，經Dicer 酶加工后生成miRNA[14-16]。miRNA與靶 mRNA 的 3'UTR結合是通過堿基配對的方式，其翻譯過程受到抑制而轉錄不被影響[17]。在細胞增殖凋亡、干細胞分化、發育以及各種疾病等生物學行為發生過程中均有靶 mRNAs的參與[18]。miRNA于機體血漿、血清中穩定存在，采用常規RNA萃取法即可獲得，機體的生理、疾病狀況等可通過檢測血清樣本中miRNA的種類、數目來反映，因此對miRNA的研究越來越廣泛[19,20]。最初于斑馬魚中克隆得到的miR-221(hsa-miR-221)，后來依次于人類 HL-60 白血病細胞、老鼠神經元細胞中得到[21]。其成簇分布，轉錄形式為大順反子，且基本上同步表達，位于X染色體p11.3區約1 kb區域內[22]。miR-221被證實在多種腫瘤細胞中表達上調，發揮促癌基因的作用；此外miR-221被敲除后可抑制小鼠血管平滑肌細胞增生以及血管內膜新生；此外有研究發現隨著年齡的增長miR-221大量減少，進而引起其靶基因 P13K 增加，揭示 miRNA 及其靶基因的變化有望用于診斷人類老齡化疾病[23-26]。

本研究首先采用Aβ1-42誘導AD大鼠模型，然后分別將miR-221過表達慢病毒質粒及空載體質粒注射于AD大鼠尾靜脈，同時設置不作任何處理的正常對照組。RT-qPCR檢測4組大鼠血清中miR-221表達水平，結果顯示正常對照組顯著高于其他3組(P<0.05)，AD+miR-221過表達組高于AD組、AD+空載體組，差異有統計學意義(P<0.05)。該結果表明Aβ1-42誘導AD大鼠模型成功，AD大鼠中miR-221表達水平顯著降低，注射miR-221過表達慢病毒質粒后，miR-221表達水平升高，與預期相符。評價實驗大鼠認知水平能力常采用水迷宮實驗，其尋找安全逃生通道的空間認知能力以逃避潛伏期來反映，本研究表明經Aβ1-42誘導后大鼠逃避潛伏期顯著延長，即認知功能顯著下降，AD大鼠體內miR-221表達水平升高后，其逃避潛伏期明顯縮短，認知功能得到提高，提示miR-221的表達與大鼠的認知功能呈正相關。作為大腦邊緣系統的一部分，海馬主要發揮學習與記憶功能，且是老年性癡呆最先遭受損傷的區域。為了進一步驗證Aβ1-42誘導的老年性癡呆大鼠miR-221的表達與認知功能的關系，采用HE染色檢測4組大鼠海馬區及大腦皮層區神經元的病理變化，結果表明AD組均嚴重受損，AD+空載體組與其受損程度相近，AD+過表達組神經元損傷得到顯著改善，且趨向于正常對照組。該結果進一步證實Aβ1-42具有神經毒性，可損傷大鼠海馬區及大腦皮質神經元，導致細胞死亡進而誘發老年性癡呆，miR-221則可逆轉老年性癡呆程度，間接說明miR-221可抑制老年性癡呆的發生。淀粉樣前體蛋白(APP)作為A β的來源，是一種跨膜糖蛋白，依次在BACE1及γ-分泌酶作用下被裂解為各種長度的Aβ，聚集形成的沉積物即可形成腦內老年斑，其中胃蛋白酶家族的BACE1主要于神經細胞中表達。本研究采用Western-blot檢測BACE1在大腦組織中的表達，結果顯示Aβ1-42誘導后老年性癡呆大鼠大腦組織中BACE1蛋白表達量明顯升高，而miR-221水平的升高抑制了BACE1的表達。提示BACE1可能是miR-221的靶基因，且miR-221對BACE1的表達發揮負向調控的作用。

綜上，miR-221可能是通過降低BACE1的表達水平進而抑制Aβ1-42誘導的大鼠老年性癡呆，提高大鼠認知功能。今后miR-221有望作為進一步研究老年性癡呆臨床檢測及治療的新靶標。