氧化苦參堿對CUMS抑郁模型小鼠抑郁樣行為的改善作用研究

張景正 陳嫻 鮑真真 鐘嫄 張思訪

抑郁癥是一種情感障礙性疾病，嚴重困擾著患者的工作、學習和生活。隨著社會的不斷發展，人們的生活和升學壓力日趨增加，使人們長期處于高度緊張的應激狀態，越來越多的人因此遭受到抑郁癥的威脅，預計到2020年，抑郁癥將成為全球第二大疾病，給更多的人帶來隱形的負擔[1]。盡管目前的抗抑郁藥物多種多樣，但是均存在著較多的不良反應，如心血管系統毒性、惡心、嗜睡、便秘、失眠、體位性低血壓和中樞神經系統毒性等[2-5]。近年來，國家將中醫藥發展納入了國家發展戰略，而且中藥是漢族傳統醫術指導下應用的藥物，與西藥相比存在不良反應較少的特點，因此從天然產物中尋找具有抗抑郁活性的中藥活性成分，成為抗抑郁藥物研究的一個重要方面。氧化苦參堿是從豆科槐屬植物苦參中提取出的生物堿，具有四環喹嗪啶類結構。臨床實驗表明其具有廣泛的藥理學作用，如抗心律失常、抗腫瘤、保肝、抗炎抗過敏等等[6-8]。近年來研究表明，氧化苦參堿可通過對抗氧自由基，對小鼠腦缺血產生保護作用[9]。另有研究表明氧化苦參堿可以通過降低體內自由基和炎性反應，對于中樞神經系統具有較好的保護作用[10]，而抑郁癥的發病也多伴隨氧化應激紊亂及炎癥的發生。除此之外，氧化苦參堿對于癲癇及阿爾茨海默病大鼠均具有較好的改善作用[11]，但是其能否改善慢性不可預知性刺激(chronic unpredicted mild stess,CUMS)導致的小鼠抑郁樣行為，目前尚未見研究報道。因此本研究通過建立CUMS抑郁小鼠模型，采用氧化苦參堿干預，觀察氧化苦參堿對于抑郁小鼠行為學的影響，并在此基礎上測定小鼠血清中單胺類神經遞質的變化，初步探究氧化苦參堿對于小鼠抑郁癥狀的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性昆明小鼠[合格證號：SYXK(蘇)2010-0011]，體重20～25 g，南京君科生物科技有限公司提供。氧化苦參堿購自陜西昂盛生物醫藥科技有限公司，含量98%，5-羥色胺(5-HT)酶聯免疫試劑盒，去甲腎上腺素(NE)酶聯免疫試劑盒，皮質醇(CORT)酶聯免疫試劑盒購自美國R&D公司，丙二醛(MDA)測定試劑盒，GSH(谷胱甘肽)測定試劑盒和過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器設備 UV-754紫外可見分光光度計、SSH-2型電熱恒溫水浴均為上海精密科學儀器有限公司產品，TGL-16G 臺式高速離心機為上海安亭科學儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠慢性不可預知性刺激模型建立：將昆明小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為正常組(Contrlol)、模型組(CUMS)、氧化苦參堿低劑量組(OMT+Low)、氧化苦參堿中劑量組(OMT+Middle)、氧化苦參堿高劑量組(OMT+Hight)、氟西汀組(Fluoxetine)。適應3 d后，除正常組外，其他各組采取孤養模式，并且每天隨機給予1～2種刺激，以復制慢性應激抑郁模型，刺激包括禁食(12 h)、禁水(12 h)、晝夜顛倒、冷水游泳(4℃，5 min)、熱水游泳(45 min，5 min)、傾斜鼠籠、潮濕墊料、束縛、夾尾、電擊足底(1 min)、震蕩，相同刺激因子不連續出現，持續接受35 d，在造模第1周開始給藥，給藥時間為每天上午9∶00，模型組注射與治療組體積相同的溶媒，氧化苦參堿低劑量組給予劑量為40 mg/kg，氧化苦參堿中劑量組給予劑量為60 mg/kg，氧化苦參堿高劑量組給予劑量為80 mg/kg，氟西汀組給予劑量為3.3 mg/kg，溶媒均為0.9%氯化鈉溶液，連續給藥5周。

1.3.2 糖水偏好實驗：造模開始前在安靜的環境內先訓練小鼠適應1%的蔗糖水，單籠飼養小鼠，每籠同時放置兩個完全相同的水瓶。在第1個24 h內，兩瓶均裝有濃度為1%的蔗糖水；第2個24 h，1瓶裝有濃度為1%的蔗糖水，1瓶裝有純水，之后取走2瓶水并稱重。實驗前和實驗第5周，分別對每只小鼠進行1次糖水偏好實驗，實驗前先禁食禁水24 h，隨后給予小鼠事先定量好的兩瓶水：1瓶為濃度1%的蔗糖水，1瓶純水，24 h后取走稱重，分別記錄蔗糖水和純水的消耗量。計算糖水偏好率，糖水偏好率 =(糖水消耗量/總液體消耗量)× 100%。

1.3.3 強迫游泳實驗：將小鼠置于高24 cm，直徑15 cm的玻璃圓缸內，水溫(25±1)℃條件下，強迫游泳6 min，觀察并記錄后4 min內小鼠的累計不動時間，當小鼠不再掙扎，浮在水中保持不動，或僅做一些必要的輕微動作保持頭部浮在水面上的時間視為累計不動時間。

1.3.4 懸尾實驗：將小鼠尾部(離尾尖約1 cm)固定于自制懸尾裝置上(由不透明材料制成，長、寬、高均為40 cm 的正方體，利用鐵架臺固定小木夾制成)，使鼠頭離箱底約10 cm，3人同時觀察小鼠6 min內的活動情況，記錄后4 min內小鼠的累計不動時間，計算取平均值。

1.3.5 曠場實驗：Open-field行為檢測箱：由不透明材料制成，底面為50 cm × 50 cm的正方形，高為20 cm的箱體，敞底面為黑色，周壁為綠色。將小鼠置于曠場中央方格內，底面被等分為25個等邊方格。觀察小鼠在5 min內水平穿越格子數和直立次數，直立次數計數標準包括兩前爪騰空、單爪或雙爪攀附箱壁，除了直立次數利用人工記錄外，其余指標采用SLY-ETS小動物行為活動記錄分析系統記錄。

1.3.6 Morris水迷宮實驗：采用Morris水迷宮檢測小鼠的學習記憶能力。水迷宮直徑為120 cm，高60 cm的圓形水池，水深15.5 cm，在第一象限正中離池壁25 cm 處放置一個直徑為10 cm，高14 cm的圓形平臺，平臺低于水面1.5 cm，水溫保持在(25±2)℃，實驗前水池中加入墨汁。小鼠連續接受4 d的訓練，每天4次，分別記錄小鼠從四個象限不同入水點入水找到平臺所需的時間，即潛伏期，4次潛伏期的平均值作為當日最終成績進入最后統計。如果小鼠在90 s內未找到平臺，應將小鼠放到平臺上，使其學習記憶，此種情況下潛伏期即為90 s，并記錄小鼠每天的游泳速度。第5天撤掉平臺，進行空間探索測試，觀察小鼠90 s內在水池內的活動，記錄小鼠到達平臺的潛伏期、在目標象限停留時間百分比以及穿越平臺的次數。

1.3.7 樣本采集及生化指標測定：實驗結束后，摘眼取血，分離血清，用于測定血清中5-HT、DA和CORT水平。斷頭取腦，采用酶聯免疫法測定小鼠腦中中谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量以及超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

2 結果

2.1 對小鼠糖水偏好率的影響 造模前，6組小鼠的糖水偏好率接近且均無顯著性差異(P>0.05)。造模和給藥5周后，與正常組相比，模型組小鼠糖水偏好率顯著降低(P<0.01)，與模型組比較，氧化苦參堿低劑量組小鼠糖水偏好率升高(P<0.05)，中高劑量組及氟西汀組小鼠糖水偏好率均顯著升高(P<0.01)。見表1。

組別糖水消耗率(%)0周5周正常組 60.33±3.5363.83±2.77模型組 61.01±2.4542.08±1.67#氧化苦參堿低劑量組60.35±2.7551.11±2.03?氧化苦參堿中劑量組57.87±2.3253.79±2.16#氧化苦參堿高劑量組61.27±2.6459.14±4.38#氟西汀組 64.41±2.3960.83±2.11#

注：與正常組比較，*P<0.05，#P<0.01

2.2 對小鼠曠場實驗的影響 實驗開始時，用曠場實驗對小鼠進行篩選，各組小鼠水平穿越格子數和直立次數均沒有明顯的變化(P>0.05)，造模和給藥5周后，與正常組相比，模型組小鼠水平穿越格子數和直立次數顯著降低(P<0.05)，與模型組相比，氧化苦參堿低劑量組小鼠水平穿越格子數和直立次數升高(P<0.05)，氧化苦參堿中高劑量組和氟西汀組小鼠水平穿越格子數和直立次數均顯著升高(P<0.05或<0.01)。見表2。

注：與正常組比較，*P<0.05，#P<0.01

2.3 對小鼠強迫游泳實驗和懸尾實驗不動時間的影響 造模和給藥5周后進行強迫游泳實驗，與正常組相比，模型組小鼠強迫游泳和懸尾不動時間均顯著升高(P<0.01)，與模型組相比，氧化苦參堿低劑量組小鼠強迫游泳和懸尾不動時間均降低(P<0.05)，氧化苦參堿中高劑量組及氟西汀組小鼠強迫游泳和懸尾不動時間均顯著降低(P<0.01)。見表3。

組別強迫游泳不動時間懸尾不動時間正常組 40.80±5.8745.80±6.37模型組 90.00±6.27#94.00±8.73#氧化苦參堿低劑量組71.30±5.64?72.10±6.76?氧化苦參堿中劑量組62.40±5.38#67.80±6.09#氧化苦參堿高劑量組58.80±5.97#63.70±4.54#氟西汀組 50.10±5.15#54.40±4.61#

注：與正常組比較，*P<0.05，#P<0.01

2.4 對抑郁小鼠學習記憶能力的影響

2.4.1 采用Morris水迷宮實驗檢測抑郁小鼠的學習記憶能力，在5 d的實驗中6組小鼠的平均潛伏期都有所下降。從第2天起，與正常組相比，模型組小鼠的潛伏期顯著升高(P<0.01)，與模型組相比，氧化苦參堿高劑量組和氟西汀組小鼠的潛伏期顯著降低(P<0.01)，其他給藥組較模型組無顯著性差異(P>0.05)；從第3天起，與模型組相比，氧化苦參堿低劑量組，小鼠的潛伏期降低(P<0.05)，氧化苦參堿中劑量組，小鼠的潛伏期顯著降低(P<0.01)；從第4天起，與模型組相比，氧化苦參堿中高劑量組及氟西汀組，小鼠的潛伏期均顯著降低(P<0.01)。見表4。

2.4.2 在目標探索實驗中，模型組小鼠在目標象限所待的百分比以及穿越平臺次數較正常組均顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，氧化苦參堿低劑量組，小鼠在目標象限的百分比及穿越平臺次數升高(P<0.05)，氧化苦參堿中高劑量組和氟西汀組，小鼠在目標象限的百分比以及穿越平臺次數均顯著升高(P<0.01)。說明抑郁小鼠的學習記憶能力較正常組顯著降低，而分別給予氧化苦參堿，氟西汀治療后，小鼠的學習記憶能力得到改善。在5天的實驗中6組小鼠的游泳速度無顯著性的差異(P>0.05)，說明6組小鼠的運動性并沒有對小鼠的潛伏期、目標象限停留時間百分比以及穿越平臺的次數造成影響。見表5、6。

組別潛伏期第1天第2天第3天第4天第5天正常組 66.84±2.8845.39±4.6231.22±3.5625.84±2.1415.63±2.45模型組 73.47±3.9370.95±4.43#66.96±4.01#56.22±3.63#39.29±3.65#氧化苦參堿低劑量組72.99±5.4966.99±3.8656.79±4.71?46.67±3.05#28.73±3.54#氧化苦參堿中劑量組70.41±3.7064.49±5.3750.97±3.03#34.81±3.10#20.32±2.54#氧化苦參堿高劑量組64.26±4.4854.57±4.47#44.71±3.19#31.37±3.26#18.50±2.80#氟西汀組 71.00±4.0852.69±3.10#40.10±3.22#27.76±2.50#16.11±2.62#

注：與正常組比較，*P<0.05，#P<0.01

組別潛伏期第1天第2天第3天第4天第5天正常組 24.36±2.3824.49±3.1425.01±2.4620.13±2.0224.71±3.74模型組 27.13±2.1427.06±2.4626.54±2.3523.67±2.5028.42±1.31氧化苦參堿低劑量組23.42±1.5222.51±1.8922.37±2.6220.05±1.7527.28±2.43氧化苦參堿中劑量組27.57±2.2925.31±1.5228.05±1.1427.52±2.4732.31±1.96氧化苦參堿高劑量組27.42±4.9123.61±0.6121.56±1.6923.76±1.4226.92±4.65氟西汀組 27.22±0.9927.23±2.7623.77±2.2625.30±1.0526.29±4.03

組別目標象限停留時間百分比(%)穿越平臺數正常組 43.67±7.275.83±1.17模型組 11.66±1.85#0.67±0.33#氧化苦參堿低劑量組30.76±3.90?3.33±0.72?氧化苦參堿中劑量組34.63±4.23#4.00±0.73#氧化苦參堿高劑量組37.13±5.62#4.50±0.81#氟西汀組 40.19±5.66#5.00±1.03#

注：與正常組比較，*P<0.05，#P<0.01

2.5 對小鼠血清中5-HT、DA和CORT水平的影響 與正常組相比，模型組小鼠血清中5-HT、DA水平顯著降低(P<0.01)，CORT水平顯著升高(P<0.01)，與模型組相比，氧化苦參堿低劑量組小鼠血清中5-HT、DA水平升高(P<0.05)，CORT水平降低(P<0.05)，與模型組相比，氧化苦參堿中高劑量組和氟西汀組小鼠血清中5-HT、DA水平顯著升高(P<0.01)，血清中CORT水平顯著降低(P<0.01)。見表7。

組別5-HT含量(ng/ml)DA含量(ng/μl)CORT含量(ng/ml)正常組 86.66±6.697.03±0.5619.01±4.48模型組 76.14±5.62#5.81±0.51#30.39±4.87#氧化苦參堿低劑量組82.56±6.71?6.50±0.63?25.48±5.38?氧化苦參堿中劑量組83.52±6.75#6.72±1.03#24.91±5.59#氧化苦參堿高劑量組85.26±5.61#7.03±0.62#21.70±4.58#氟西汀組 88.25±3.97#7.05±0.49#22.28±4.44#

注：與正常組比較，*P<0.05，#P<0.01

2.6 對小鼠腦組織中谷胱甘肽含量(GSH)和丙二醛(MDA)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)的活性的影響 與正常組相比，模型組小鼠腦中MDA含量顯著升高(P<0.01)，GSH含量顯著降低(P<0.01)，SOD活性顯著降低(P<0.01)，與模型組相比，氧化苦參堿低劑量組小鼠腦中MDA含量降低(P<0.05)，GSH含量升高(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，氧化苦參堿中高劑量組及氟西汀組小鼠腦中MDA含量均顯著降低(P<0.01)，GSH含量均顯著升高(P<0.01)，SOD活性均顯著升高(P<0.01)。見表8。

組別SOD活性(U/mgprog)MDA含量(nmol/mgprog)GSH含量(mg/gprog)正常組 68.38±6.5427.20±3.8120.11±2.81模型組 56.75±7.27#34.48±6.47#15.62±2.74#氧化苦參堿低劑量組63.72±8.10?29.18±3.74?18.85±3.80?氧化苦參堿中劑量組66.72±5.87#28.12±3.63#19.45±1.83#氧化苦參堿高劑量組67.45±5.31#25.49±3.15#20.07±1.66#氟西汀組 69.96±7.07#26.71±3.89#20.58±2.02#

注：與正常組比較，*P<0.05，#P<0.01

3 討論

抑郁癥是一種復雜的情感障礙性疾病，促發因素多種多樣，而我們現代社會比較常見的就是高壓力的應激性生活，這類應激性生活事件具有慢性、低強度、長期存在的特點。為了較好的模擬這種生活狀態，本文采用慢性不可預知性刺激建立抑郁小鼠模型，它也是目前國際認可的科學評價抗抑郁藥物的主要動物模型[12，13]。本實驗成功復制CUMS小鼠抑郁模型，與正常組相比，模型組小鼠糖水偏好率、水平穿越格子數和直立次數明顯降低，強迫游泳和懸尾實驗中小鼠不動時間明顯延長，水迷宮實驗結果顯示，與正常組相比，模型組小鼠的潛伏期明顯降低，目標象限停留時間及穿越平臺次數明顯升高，以上結果表明通過35 d的慢性不可預知性刺激，小鼠明顯產生興奮度降低，自主活動度降低，認知功能降低的現象，而此類行為學變化恰好為抑郁癥患者的主要表現。給予氧化苦參堿干預后，小鼠以上行為學上的異常明顯得到改善，給予氟西汀干預組小鼠的行為學異常也明顯得到改善。由此表明氧化苦參堿可能具有一定的抗抑郁作用。

HPA軸作為神經內分泌系統的重要成分是機體應對應激刺激的主要反應途徑，在機體受到應激刺激時，HPA軸會在CRH的作用下被啟動，進而產生一系列的連鎖反應[14]，導致HPA軸過度激活，其中血清CORT大量分泌是HPA軸亢進的重要指標，并且有研究表明高濃度的CORT可選擇性的損傷大腦的海馬神經元，是抑郁癥產生的生理生化基礎之一[15]。本實驗結果顯示，慢性不可預知性刺激導致小鼠血清中CORT含量明顯升高，HPA功能明顯亢進，而不同劑量的氧化苦參堿與陽性給藥組表現出一致的作用，由此可以看出氧化苦參堿在一定程度上抑制HPA軸的亢進，顯著降低血清中CORT水平。

抑郁癥的發病機制多種多樣，其中比較公認的就是“單胺假說”，該學說認為，抑郁癥的生物學基礎是：由于相關腦區神經遞質的合成或儲存減少、降解增加或受體功能的改變，導致特定的神經傳導通路上的單胺的功能下降[16]。單胺類神經遞質包括5-HT、DA、多巴胺等，這些神經遞質，主要影響人的精神活動、情緒反應和學習記憶等功能。因此，本研究，通過測定小鼠血清中5-HT和DA的含量來檢測各組小鼠的抑郁情況。實驗結果表明，慢性不可預知性刺激可以明顯降低小鼠血清中5-HT和DA的含量，再次驗證了相關文獻的結論，除此之外，不同劑量的氧化苦參堿與陽性給藥組均可以明顯降低小鼠血清中5-HT和DA的含量，這可能與其改善小鼠抑郁樣行為密切相關。

抑郁癥的發生除了與HPA軸功能亢進有關之外，還與神經系統的氧化應激失衡密切相關[17,18]。腦組織對于氧自由基導致的損傷非常敏感，過度的氧自由基堆積，容易引起機體的氧化損傷，而這種損傷可能會引起精神障礙，因而氧化應激系統激活可能是導致抑郁癥患者認知功能損傷的重要原因之一。SOD是體內重要的自由基清除劑，其功能受到影響是導致大量自由基堆積的重要原因。GSH和MDA的含量直接代表著小鼠腦內氧化應激的水平。由此本研究，通過測定小鼠腦中GSH和MDA的含量以及SOD的活性來探究其可能的作用機制。實驗結果表明，抑郁小鼠腦中氧化應激系統出現明顯失衡，而給予氧化苦參堿及氟西汀分別進行干預后，其氧化應激系統得到改善，這可能與其認知功能得到改善密切相關。