0～3月齡嬰兒化膿性腦膜炎腦脊液病原菌分布及耐藥性分析

李雪琴 王 勤 王江濤 王曉玲 趙愛玲 谷惠茹

鄭州大學附屬兒童醫院 河南省兒童醫院 鄭州兒童醫院，河南 鄭州 450018

化膿性腦膜炎(purulent meningitis，PM)又稱細菌性腦膜炎，是各種化膿性細菌引起的腦膜炎癥，部分患者病變累及腦實質，嬰幼兒時期常見的中樞神經系統感染性疾病，嬰幼兒病死率10%，10%～20%的幸存者遺留各種神經系統嚴重后遺癥。PM后最常見的中度到重度后遺癥是感覺神經性聽力損失、神經運動障礙和智力低下，輕微的后遺癥包括學習和行為障礙[1]。PM在出生后的第1個月比其他任何時期更常見，而且在嬰兒中經常伴有早發型敗血癥和晚發型敗血癥[2]。頭骨、脊椎、腦膜、血腦和血腦脊液界面的細胞屏障能很好地保護大腦和腦膜免受微生物入侵。然而，一旦進入血液，一系列病原菌就可能到達大腦并引起腦膜炎[3]。因此，早診斷、有效治療對于PM的預后具有重要意義。腦脊液(erebrospinal fluid，CSF)檢查是目前確診本病的重要依據，為使患兒得到更有效的治療，需了解PM的常見病原體及耐藥情況。

多重耐藥菌(multi-drug resistant organisms，MDRO)主要是指對臨床使用的三類或三類以上抗菌藥物同時呈現耐藥的菌株。目前，由MDRO引起的嚴重感染的發病率在全球范圍內呈上升趨勢，越來越多的新生兒和兒童因耐藥細菌而發生嚴重的血液感染[4]。0～3月齡PM患兒CSF病原菌的分布及耐藥情況目前國內外報道甚少，本文對2015-01-01—2019-12-31在鄭州大學附屬兒童醫院新生兒診療中心住院的0～3月齡PM患兒175株CSF培養陽性病原體進行回顧性分析，了解不同年齡段的PM患兒的病原體分布及隨時間推移病原體的變遷，并將PM患兒病原菌的耐藥情況作了進一步分析。

1 材料與方法

1．1標本來源及納入標準標本來源于2015-01-01—2019-12-31在鄭州大學附屬兒童醫院新生兒診療中心住院的0～3月齡患兒送檢的5 310份腦脊液標本，共培養出陽性病原體175株，來自161位PM患兒，男女比例為1.3∶1，其中14例患兒CSF培養檢測出2種病原體。同一患兒在同一住院期間分離的相同菌株不計入細菌總數。所有菌株按常規方法進行細菌分離、培養及鑒定。

納入標準：161例CSF培養陽性的研究對象，其臨床表現、病原學檢查、血液非特異性檢查及CSF檢查均符合人民衛生出版社《兒科學》第9版化膿性腦膜炎診斷標準，年齡0～3月齡。

1．2儀器及方法為了解不同年齡組CSF病原菌分布情況，將0～3月齡入選患兒分為3組：早期新生兒組(0～7 d)、晚期新生兒組(8～28 d)及29 d～3月齡小嬰兒組。CSF培養：對臨床可疑中樞神經系統感染患兒，嚴格無菌操作下采集CSF 1～2 mL，1 h內送微生物室進行培養。按照《全國臨床檢驗操作規程》進行培養、分離、鑒定。采用德國bruker質譜儀進行細菌鑒定，藥敏試驗采用法國梅里埃公司生產的VITEK2全自動細菌鑒定及藥敏分析系統和美國BD全自動細菌鑒定及藥敏分析系統，藥敏試驗采用MIC法，若培養5 d仍為陰性則報告陰性。

1．3結果判定檢出率是指被檢標本中陽性標本出現的百分率。耐藥率是指耐藥菌株占總檢出菌株的百分比。構成比是表示某事物內部各組成部分在整體中所占的比重。最小抑菌濃度(MIC)指在體外能達到抑制細菌生長的最小抗菌藥物濃度。藥敏判定結果按照臨床和實驗室標準協會(CLSI)推薦的最新版《抗微生物敏感性試驗的執行標準》要求進行。

1．4統計學方法采用統計軟件SPSS 22.0進行數據分析。計數資料采用率或百分比(%)進行統計描述，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

本組患兒CSF培養共檢出病原菌175珠，檢出率3.3%(175/5310)。以革蘭陽性(gram-positive，G+)菌為主，構成比68%(119/175)，革蘭陰性(gram-negative，G-)菌的構成比為32%(56/175)。構成比排名前7位的分別為大腸埃希菌(34株)、表皮葡萄球菌(25株)、屎腸球菌(23株)、溶血葡萄球菌(17株)、人葡萄球菌(14株)、肺炎克雷伯菌(13株)；B群無乳鏈球菌(group B Streptococcus，GBS)(10株)。

2．1CSF培養病原菌的年齡組分布早期新生兒組檢出41株，G+菌占73.2%(30/41)，G-菌占26.8%(11/41)；晚期新生兒組檢出71株，G+菌占62%(44/71)，G-菌占38%(27/71)；29 d～3月齡小嬰兒檢出63株，G+菌占71.4%(45/63)，G-菌占28.6%(18/63)。3個年齡組病原菌G+菌、G-菌構成比差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同年齡組 G+菌、G-菌構成比比較

注：χ2=2.03，P=0.374

不同年齡組患兒的CSF菌株構成比排名又不盡相同。早期新生兒組排名前5位的菌株分別為表皮葡萄球菌 (12.2%，5/41)、肺炎克雷伯菌(12.2%，5/41)、GBS(9.8%，4/41)、人葡萄球菌(9.8%，4/41)、屎腸球菌(9.8%，4/41)；晚期新生兒組排名前5位的分別為大腸埃希菌 (25.3%，18/71)、表皮葡萄球菌(14.1%，10/71)、溶血葡萄球菌(14.1%，10/71)、屎腸球菌(12.7%，9/71)、肺炎克雷伯菌(8.5%，6/71)；29 d～3月齡小嬰兒組排名前5位的分別為：大腸埃希菌(19.0%，12/63)、表皮葡萄球菌(15.9%，10/63)、屎腸球菌(15.9%，10/63)、人葡萄球菌(9.5%，6/63)、金黃色葡萄球菌(7.9%，5/63)。

2．2前后2.5aCSF培養病原菌檢出情況比較2015-01-01—2017-06-30本中心PM患兒CSF培養共檢出病原菌86株，其中G+病原菌64株，G-病原菌22株；2017-07-01—2019-12-31 CSF培養共檢出病原菌89株，其中G+病原菌55株，G-病原菌34株。前后2.5 a比較，G+病原菌構成比呈下降趨勢，G-病原菌構成比有上升趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2．3CSF培養藥敏結果

2．3．1 CSF培養MDRO分布：本中心CSF培養病原菌共檢出MDRO 77株，耐藥率44%(77/175)，構成比排名前5位的MDRO依次為耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(methicillin-resistant coagulase negative staphylococci，MRCNS)(32.5%，25/77)、產超廣譜-內酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase，ESBLs)菌株(22.1%，17/77)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus epidermidis，MRSE)(19.5%，15/77)、碳青霉烯類耐藥腸桿菌(carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE)(14.3%，11/77)、氨基糖苷類高水平耐藥 (high-level aminoglycoside resistant，HLAR)菌株(7.8%，6/77)。6株HLAR菌株全部為屎腸球菌；17株ESBLs菌株中15株為大腸埃希菌菌，2株為肺炎克雷伯菌；11株CRE菌株中10株為肺炎克雷伯菌，1株為大腸埃希菌。CSF病原菌中G-菌的耐藥率(58.9%，44/119)明顯高于G+菌的耐藥率(37%，33/56)，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 前后2.5 a G+菌、G-菌構成比比較

注：χ2=3.202，P=0.078

表3 CSF中G+及G-菌株耐藥率比較

注：χ2=7.449，P=0.009

2．3．2 CSF培養病原菌對常用抗生素耐藥情況：本中心CSF培養構成比排名前6位的病原菌G-菌株包括大腸埃希菌及肺炎克雷伯菌，G+菌株包括表皮葡萄球菌、屎腸球菌、溶血葡萄球菌及人葡萄球菌。檢出率較高的G+菌株對常用抗生素的耐藥情況見表4，G-菌株對常用抗生素的耐藥情況見表5。大腸埃希菌耐藥率為0的僅有阿米克星，哌拉西林耐藥率為100%，耐藥率<10%的有美羅培南、亞胺培南、哌拉西林他唑巴坦。肺炎克雷伯菌耐藥率均在50%以上，美羅培南、亞胺培南、哌拉西林他唑巴坦耐藥率均為83.3%。表皮葡萄球菌、屎腸球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌對萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺的耐藥率均為0。表皮葡萄球菌對氨芐西林及青霉素的耐藥率均為100%，溶血葡萄球菌對紅霉素的耐藥率為100%，屎腸球菌對克林霉素、利福平、復方新諾明及阿米卡星的耐藥率均為100%。真菌對常用抗真菌藥物均敏感。

表4 G+菌株對常用抗生素的耐藥率

3 討論

2015—2019年鄭州大學附屬兒童醫院新生兒診療中心共收集0～3月齡PM患兒CSF培養陽性病原菌175珠，總檢出率3.3%(175/5 310)，明顯低于我國華南部分地區新生兒細菌性腦膜炎腦脊液的病原體陽性培養率33.0%[5]，考慮與我院臨床醫師更重視腦CSF原菌的培養，CSF標本送檢率較高有關，其中一部分患兒最終并未臨床診斷為PM，至CSF病原菌陽性檢出率較低；另外，考慮與本院患兒大多數是由外院轉診入院，在進行CSF培養前已應用抗菌藥物有關。目前已有利用基因測序快速診斷細菌性腦膜炎的檢測方法[6-7]，在此技術還未廣泛應用于臨床之前，雖然CSF培養陽性率較低，但仍能夠有效指導臨床合理用藥。

不同年齡段的PM患者CSF常見病原菌亦存在差異。成人及兒童PM病原體有很大差別，方霞等[8]報道當地成人PM病原體以新型隱球菌感染為主，但兒童新型隱球菌感染少見。不同年齡段的兒童PM病原體亦有差異，文獻報道新生兒PM最常見的病原菌是GBS和大腸埃希菌[3]。本研究0～3月齡PM患兒CSF病原菌檢出率排名前7位的分別為大腸埃希菌、表皮葡萄球菌、屎腸球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、GBS，G+菌構成比68%(119/175)，G-菌的構成比為32%(56/175)。本文GBS檢出率較國內外文獻報道低，考慮可能與我院沒有產科，患兒主要來源為各地危重癥患兒轉診，可能存在大量輕癥GBS患兒未到我院就診有關。

表5 G-菌株對常用抗生素的耐藥率

本文早期新生兒組GBS構成比排名較其他兩組靠前，考慮與孕母GBS感染所致宮內感染或經陰道分泌物垂直傳播有關。晚期新生兒及小嬰兒組CSF培養大腸埃希菌構成比均排名第1位，與ZHAO等[9]的報道相符，考慮與此年齡段患兒易暴露于大腸埃希菌有關。同時，我院住院新生兒多為醫聯體單位轉診的重癥患兒，機械通氣的比率較高，外院住院有應用抗菌藥物史，醫院感染率較高亦不能除外。68%的G+菌中以凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase negative staphylococci，CNS)為主，CNS是皮膚、口腔黏膜等部位的正常菌群，以往臨床中常把CNS視為污染菌，但近年來國內文獻報道CSF培養陽性菌主要為CNS[10]，國外文獻亦有條件葡萄球菌致人類腦膜炎的報道[11]，因此，當CSF中檢出CNS，應結合患兒的臨床表現和CSF常規、生化、血培養等檢查結果判斷是否為致病菌，避免不合理用藥。

本中心2015-01-01—2017-06-30 PM患兒CSF培養檢出細菌中G+菌構成比為74.4%，G-菌構成比為25.6%，2017-07-01—2019-12-31 PM患兒CSF培養檢出細菌中G+菌構成比為61.8%，G-菌構成比為38.2%，前后2.5 a比較，G+菌構成比呈下降趨勢，G-菌構成比呈升高趨勢，雖差異無統計學意義(P=0.078)，但已有文獻報道新生兒CSF培養病原菌中G-菌有逐年上升趨勢[10]，應繼續監測其動態變化。

隨著抗生素的廣泛應用，病原菌耐藥現象已引起全球關注。已有文獻綜述抗生素的使用與隨后的醫院感染或MDRO在兒童中的定植之間呈正相關[12]。本研究PM患兒CSF培養病原菌的多重耐藥率高達(44%)，G-菌的耐藥率(58.9%)高于G+菌(37%)(P<0.05)。檢出率排名前5位的MDRO重點菌分別為MRCNS、ESBLs菌株、MRSE、CRE、HLAR菌株。6株HLAR菌株全部為屎腸球菌，ESBLs菌株中主要為大腸埃希菌(88.2%)，CRE菌株中主要為肺炎克雷伯菌(88.2%)。段雪亞等[13]報道當地神經內外科住院患者CRE中肺炎克雷伯菌占86.78%，FANG等[14]報道肺炎克雷伯菌是CRE的主要分離株，占標本的74.5%，與本研究結果基本相符。近幾年來，CRE在世界范圍內迅速蔓延，給人類健康帶來了巨大的挑戰，質粒介導的碳青霉烯類耐藥基因水平傳播是CRE流行激增的主要原因。產生對碳青霉烯類抗生素耐藥性的主要機制有3種：酶的產生、外排泵和孔蛋白突變，其中酶的產生是主要的抗性機制，對碳青霉烯類耐藥主要有三類酶，所有這3組酶都是質粒介導的[15]。治療CRE感染的一線抗生素目前為多黏菌素，與多黏菌素相比，新的抗CRE抗生素，如頭孢他啶-阿維巴坦、美羅培南-瓦博巴坦、廣場霉素改善了CRE感染患者的預后，并降低了毒性，有望成為一線用藥[16]。MRCNS為低毒性條件致病菌，感染后癥狀不典型，且呈多重耐藥現象，給臨床診斷及治療帶來一定難度。加強感染預防，包括手部衛生、監測培養、接觸預防、選擇性隔離和抗生素管理是減少病區耐藥性的重要策略[17]。相關文獻報道個性化檢測病原菌可能與降低ICU中的MDRO有關[18]。相關疫苗研制也為人類預防及治療細菌性腦膜炎帶來了希望。研究顯示，部分益生菌具有抗CRE活性，為控制或預防CRE定植或感染提供了潛在的應用前景[19]。

目前，有關G+菌株耐藥的報道逐年增多。本中心CSF中表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌對萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺的耐藥率均為0，對青霉素的耐藥率分別為100%、87.5%、92.9%，提示青霉素已不再是治療PM的首選抗菌藥物。屎腸球菌對克林霉素、利福平、復方新諾明、慶大霉素、阿米卡星耐藥率均為100%，臨床不宜選用，對萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺的耐藥率均為0，因此，這3種藥物對耐藥的屎腸球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌感染的治療效果相對可靠。文獻報道呋喃妥因對萬古霉素耐藥的腸球菌具有較好的體外抗菌作用[20]，本研究中屎腸球菌對呋喃妥因的耐藥率為僅9.1%，僅次于萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺，所以呋喃妥因亦為臨床治療提供了新的選擇。本研究顯示G-菌的耐藥率明顯高于G+菌。大腸埃希菌對哌拉西林耐藥率為100%，對氨芐西林的耐藥率為96.7%，但對哌拉西林他唑巴坦、亞胺培南、美羅培南的耐藥率在10%以內，對阿米卡星耐藥率為0，可供臨床選用抗菌藥物參考。肺炎克雷伯菌的耐藥率除莫西沙星(50%)和氯霉素(63.6%)外，其他常用抗菌藥物耐藥率均在70%以上，臨床選藥比較困難。最近研究表明，對抗細菌穿透血腦屏障的靶點在改善細菌性腦膜炎的預后方面是抗菌治療的有益輔助治療手段[21]。建立機構抗菌藥物管理計劃被認為是減少醫院抗生素消費和解決MDRO高比率的關鍵干預措施。

鄭州大學附屬兒童醫院0～3月齡PM患兒CSF病原菌以G+菌為主，大多數是條件致病菌，G-菌的耐藥率高于G+，考慮因近年來大量廣譜抗菌藥物的廣泛使用所致。不同年齡組病原菌分布又有所差別。臨床醫生詳細了解病區感染病原菌分布及耐藥性變化趨勢，能更有針對性地應用抗菌藥物，指導臨床治療。