G10631A和C521T基因多態性與腦梗死相關性

杜家琇 楊冬冬 趙 萌 張淑玲

鄭州人民醫院神經內科，河南 鄭州 450003

腦梗死是最常見的腦血管疾病，是由于腦組織急性缺血而引起的神經功能障礙，大多數突然發病，病情進展快，致殘致死率高。近年來，發病率呈上升趨勢，占全部腦卒中的60%～80%，已成為嚴重威脅中老年人生命健康的主要疾病之一[1-3]。過去數十年，通過對腦血管病危險因素的研究及預防使腦梗死的發病率及病死率明顯有所下降，但其發病率存在個體差異的原因及動脈粥樣硬化形成的病理生理機制仍不明確。

家族遺傳史是腦血管疾病重要的不可控因素之一，隨著分子遺傳學技術的進步，腦梗死發病機制相關基因遺傳學研究也日益受到關注[3-4]，尋找腦梗死疾病的相關致病基因成為新興的研究熱點。國內外大量的研究表明，腎素-血管緊張素系統(renin angiotensin system，RAS)系統激活在高血壓、高血脂、冠心病的發生、發展過程中起著重要作用[5-6]，而RAS多態性參可能參與動脈粥樣硬化形成全過程的調節，RAS基因多態性增加動脈粥樣硬化、心血管疾病的風險，其與高血壓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等心血管系統疾病相關性的研究已較多，但RAS基因多態性與腦梗死相關性的研究較少[7-8]。

本研究采用酚/氯仿法提取DNA，限制性片段長度多態性(PCR-restriction fragment length polymorphisms，PCR-RFLP)分析法檢測G10631A和G521T的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)，旨在探討腎素基因G10631A及血管緊張素基因C521T的單核苷酸多態性及單體型與腦梗死的相關性，以期從遺傳基因水平為腦梗死易感者的早期識別與篩查提供理論依據。

1 資料與方法

1．1一般資料選擇2016-05—2019-05月鄭州市人民醫院神經內科收治的腦梗死患者為研究對象，病例納入標準：(1)符合腦梗死診斷標準，并經CT、磁共振成像檢查確診為腦梗死；(2)患者之間無血緣關系；(3)病歷資料完整。排除標準：并發其他類型腦血管疾病、血液系統疾病、腫瘤、顱內感染、自身免疫性疾病及嚴重肝、腎功能不全者。該研究共納入腦梗死患者100例(腦梗死組)，男70例，女30例；年齡35～80(59.5±10.2)歲，病程1～90(45.4±7.8)d。另選擇同期健康志愿者作為對照，納入標準：(1)身體健康，資料信息完善；(2)既往無腫瘤、腦血管疾病、慢嚴重代謝性疾病史；(3)受試者之間無血緣關系。該研究共納入健康志愿者100例，男68例，女32例，年齡34～80(60.1±10.5)歲。

1．2主要試劑與儀器A200型快速PCR儀(上海般諾生物科技)；Cosmo Bio 新型精簡瓊脂糖凝膠核酸電泳儀(Cosmo Bio公司生產)；擴增引物(賽默飛世爾科技(中國)有限公司生產)；FastDigest快速限制性內切酶(賽默飛世爾科技(中國)有限公司生產)。

1．3G10631A和C521T基因多態性檢測采集2組受試者空腹靜脈血，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，置于-70 ℃ 冰箱保存，以備 DNA 提取。采用酚/氯仿法提取DNA，限制性片段長度多態性分析(PCR-restriction fragment length polymorphisms，PCR-RFLP)法檢測G10631A和G521T的SNP。G10631A的引物設計參照FRPSSARD等[9-10]的研究，上游引物序列為5'-TGAGGTCGAGTCGGCCCCCT-3'，下游引物序列為5'-TGCCCAAACATGGCCACACAT-3'。C521T的引物設計參照CAULFIELD等[11-12]的研究，上游引物序列為5'-GATGCGCACAAGGTCCTG-3'，下游引物序列為5'-CAGGGTGCTGTCCACACTGGCTCGC-3'。PCR-RFLP操作流程如下：取用已制備好的模板DNA 1.8 μL加入PCR反應混懸液中，混勻，液態石蠟封頂；然后進行PCR擴增。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，重復35個循環；最后72 ℃延伸5 min。取G10631A擴增產物10 μ0，加入內切酶MboⅠ 10 U、100 U酶A環頂TGTμ0，混勻，37℃下反應16 h后終止。取G521T擴增產物10 μ0，加入內切酶NcoⅠ 10 U、100 U酶A環頂TGTCCμ0，混勻，37 ℃下反應4 h后終止。反應后產物均行20 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳基因分型。G10631A基因PCR擴增后產物為250 bp DNA片段，酶切反應后若出現171 bp和79 bp條帶則為AA型；若出現250 bp、171 bp和79 bp條帶則為GA型，若出現250 bp和79 bp條帶則為GG型。G521T基因PCR擴增后產物為303 bp DNA片段，若出現211 bp和92 bp條帶則為TT型，若出現303 bp、211 bp和92 bp條帶則為CT型；若只出現303 bp條帶則為CC型。

1．4統計學處理采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。采用基因計數法計算G10631A和C521T基因型與等位基因頻率，2組基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗；采用Logistic回歸分析G10631A、C521T基因多態性與腦梗死患病風險的相關性，采用Shesis軟件計算G10631 A和C521 T的單體型頻率；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2．12組受試者G10631A基因型及等位基因頻率比較結果見表1。腦梗死組患者G10631A的AA基因型及A等位基因頻率均高于對照組，差異有統計學意義(χ2=8.672、10.172，P<0.05)。

2．22組受試者C521T基因型及等位基因頻率比較結果見表2。腦梗死組患者C521T的TT基因型及T等位基因頻率均高于對照組，差異有統計學意義(χ2=8.665、22.118，P<0.05)。

2．3G10631A和C521T基因型與腦梗死患病風險的相關性結果見表3。G10631A的AA基因型、C521T的TT基因型可增加腦梗死發生率(OR=2.039、2.031，P<0.05)。

表1 2組受試者G10631A基因型及等位基因頻率比較 [n(%)]

表2 2組受試者C521T基因型及等位基因頻率比較 [n(%)]

表3 G10631A和C521T基因型與腦梗死患病風險的相關性

2．4G10631A和C521T的單倍型與腦梗死患病風險的相關性結果見表4。G10631A與C521T可構建A-C、A-T、G-C及G-T共4個單體型，并以G-C最常見。腦梗死組患者A-T單體型出現頻率高于對照組，差異有統計學意義(χ2=16.127，P<0.05)，但腦梗死組G-C單體型出現頻率低于對照組，差異有統計學意義(χ2=17.368，P<0.05)。

表4 G10631A和C521T的單倍型頻率與腦梗死患病風險的相關性

3 討論

腦梗死即缺血性卒中，是局部腦組織的血液供應障礙導致的腦組織功能受損及缺氧性壞死。既往研究發現高血壓、糖尿病、肥胖、吸煙等代謝相關或不良生活習慣等均為腦梗死發生重要危險因素[13-14]。腦梗死的發病機制尚未完全闡明，但是其可能與動脈粥樣硬化過程密切相關，動脈粥樣硬化是腦梗死最常見原因[4，15]。RAS系統在高血壓疾病形成過程中所起的重要作用已得到很多研究支持[4，16]，但在與高血壓密切相關的腦血管病發生、發展中所起的作用并不完全清楚，爭論頗多。隨著遺傳學研究技術手段的進步，探究腦梗死發病相關基因成為可能，RAS系統作為心腦血管的重要調節因素，其與腦梗死的相關性逐漸得到關注[17]。本研究探討G10631A和C521T基因多態性與中國漢族人群腦梗死發生的關系，從而為腦梗死早期預防提供新的臨床上的治療靶點。

腎素主要通過催化血管緊張素原轉化為血管緊張素Ⅰ而激活RAS系統，其作為RAS系統的重要組分而備受關注[18-20]。腎素基因位于1q21.3-32.3，全長約12.5kb，包含10個外顯子及9個內含子，近些年的研究位點多集中在Bgl Ⅰ(第一內含子)、Mbo Ⅰ(第九內含子)、Hind Ⅲ、Bgl Ⅱ(均位于3’側鏈區)和Taq I(位于5’側鏈區)等多個限制性片斷長度多態性。G10631A屬第9內含子中第10631位G(鳥嘌呤)被A(腺嘌呤)替代[21]。FROSSARD等[9]曾在美國人群中研究腎素-血管緊張素系統G10631A基因與卒中的關系，結果發現卒中組AA基因型和A等位基因頻率均顯著高于對照組(P<0.05)，認為G10631A多態性是卒中的危險因素，該研究結論也在國內的一些研究中得到證實。本研究結果顯示，腦梗死組患者G10631A的AA基因型及A等位基因頻率均高于對照組(χ2=8.672、10.172，P<0.05)，且G10631A的AA基因型可增加腦梗死發生率，差異有統計學意義(OR=2.039，P<0.05)，提示G10631A的AA基因型及A等位基因可能是腦梗死的易感因素。

人的血管緊張素原基因定位于常染色體1q42-43上，它是一個長度約為12kb的單拷貝基因，包含5個外顯子和4個內含子，血管緊張素原基因結構上存在至少16個多態位點，C521T屬第2外顯子中第521位胞嘧啶被胸腺嘧啶替換[22]，使編碼第174位蘇氨酸(T)變為蛋氨酸(M)，即C521T突變。國內外關于C521T基因多態性與腦血管疾病的關系研究數量少，目前的研究支持基因C521T多態性與腦梗死存在相關性，但具體的發病機制目前并不清楚。本研究結果顯示，腦梗死組患者C521T的TT基因型及T等位基因頻率均高于對照組(χ2=8.665、22.118，P<0.05)，且C521T的TT基因型可增加腦梗死發生率，差異有統計學意義(OR=2.031，P<0.05)，提示C521T的TT基因型及T等位基因可能是腦梗死的易感因素，這與有關研究結果基本一致[21]。

單體型是指同一個染色體上多個單核苷酸的組合，即不同基因或同一基因的不同位點在同一條染色體上的組合[22]。單體型可盡可能地減少遺傳分析的復雜性，相對單位點基因型來說，單體型可以更精確地預測某一個基因的活性。腦梗死相關的基因位點非常多，而基因間的相互作用以及各種周圍環境因素所起的作用不易確定，因此將多個單核苷酸位點進行單體型分析比單位點分析更具有遺傳學及臨床指導意義。G10631A與C521T可構建A-C、A-T、G-C及G-T共4個單體型，并以G-C最常見，本研究結果顯示，腦梗死組患者A-T單體型出現頻率高于對照組(χ2=16.127，P<0.05)，但腦梗死組患者G-C單體型出現頻率低于對照組(χ2=17.368，P<0.05)，提示A-T單體型可能與腦梗死的發生有關，可能是腦梗死的重要遺傳易感因素。

盡管如此，本研究仍存在一些不足，樣本量有限，且并未對腦梗死進行分型，而相關基因型與腦血管病眾多危險因素之間的關系未能明確，因此有必要進行大樣本量來證實G10631和C521T基因多態性與腦梗死相關性。

RAS中G10631A的AA基因型和A等位基因、G521T的TT基因型和T等位基因及A-T單體型可能是腦梗死的遺傳易感因素。但是G10631A和C521T基因到底如何影響腦梗死的發病過程，具體機制仍不清楚，研究者一般認為可能通過氧化應激、炎癥因子及內皮細胞的作用等影響動脈粥樣硬化形成和腦血管疾病的發生、發展，仍需進行大量的更深入的研究。