重慶市耐多藥結核分枝桿菌對貝達喹啉和德拉馬尼的藥物敏感性研究

羅 明，張匯征，嚴曉峰，曹培明，廖傳玉，何 瑛，李曉旭，王 靜，李同心，陳耀凱

結核病(tuberculosis，TB)由結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)引起，是威脅人類健康的重要傳染病之一。據世界衛生組織(world health organization，WHO)估計，2018年全球約有1 000萬新發結核病例[1]。由于長期沒有新的抗結核藥物推出，結核病的耐藥問題日益嚴重。據WHO估計，2018年全球共新發約39萬例耐多藥結核(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)，其中約6.2%為廣泛耐藥結核(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)[1]。MDR-TB的治療非常困難，不僅療程長，費用高，而且治愈率僅為56%左右，而XDR-TB的治愈率更是低至39%[1-2]。貝達喹啉(bedaquiline，Bdq)和德拉馬尼(delamanid，Dlm)是近50年來首次推出的具有全新作用機制的抗結核藥物，因此引起了廣泛關注，但目前國內少見有關這兩種藥物耐藥性的研究[3-4]。本研究通過檢測貝達喹啉和德拉馬尼對重慶市MDR-TB臨床分離菌株的體外抑菌活性，初步了解重慶市MDR-TB菌株對這兩種新藥的敏感性，為兩種藥物的臨床應用提供實驗室依據。

1 材料與方法

1.1菌株來源 共有111株MDR-TB臨床分離結核分枝桿菌菌株納入研究。所有菌株均來自2017年11月至2018年11月間經重慶市公共衛生醫療救治中心結核實驗室培養分離并經藥敏試驗鑒定為MDR-TB的陽性培養物。標準菌株為中國疾病預防控制中心結核病實驗室提供的結核分枝桿菌H37Rv(ATCC27294)。

1.2試劑和儀器 中性羅氏培養基和結核分枝桿菌藥敏檢測試劑盒(比例法)由珠海銀科醫學工程有限公司生產。7H9肉湯培養基、OADC增菌液、吐溫80及DMSO均購自西格瑪公司。Bdq、Dlm(純度≥98%)購自杭州光遠生物技術有限公司。刃天青鈉購自生工生物工程(上海)股份有限公司。細菌超聲分散計數儀由廣東希格生物科技有限公司生產。

1.3 方 法

1.3.1比例法藥敏檢測 參照結核分枝桿菌藥敏檢測試劑盒說明書及《結核病診斷實驗室檢驗規程》，對分枝桿菌陽性培養物進行利福平(rifampin，Rif，40 μg/mL)、異煙肼(isoniazid， H，0.2 μg/mL)、鏈霉素(streptomycin，Sm，4 μg/mL)、乙胺丁醇(ethambutol，E，2 μg/mL)、對氨基水楊酸(para-aminosalicylic acid，Pas，1 μg/mL)、阿米卡星(amikacin，Am，30 μg/mL)、利福噴丁(rifapentine，Rft，40 μg/mL)、丙硫異煙胺(prothionamide，Pto，40 μg/mL)、卷曲霉素(capromycin，Cm，40 μg/mL)、左氧氟沙星(Levofloxacin，Lfx，2 μg/mL)等抗結核藥物藥敏檢測，耐藥判定標準參照WHO的相關推薦標準[5-6]。使用對硝基苯甲酸(p-nitrobenzoic acid, PNB)鑒別結核分枝桿菌(tuberculosis，TB)與非結核分枝桿菌(non-tuberculosis mycobacterium，NTM)，菌株在PNB生長判定為NTM[5]。

1.3.2最小抑菌濃度法(minimum inhibitory concentration, MIC)藥敏檢測 采用最小抑菌濃度法(MIC)檢測MTB臨床分離株對Bdq和Dlm的敏感性。按照《結核病診斷實驗室檢驗規程》操作，倍比稀釋制備含Bdq和Dlm的96孔板，藥物濃度梯度均設置為0.016至16 mg/L[5]。刮取羅氏培養基上處于生長對數期的培養物，經超聲分散重懸后，用7H9培養基配成1個麥氏濃度溶液，按1∶10稀釋至含10% OADC的7H9培養基中。在制備好的藥敏平板每孔加入稀釋后的菌液100 μL，37 ℃恒溫培養7 d。每孔加入20 μL刃天青顯色液，再在37 ℃培養24 h后觀察顯色讀取MIC，完全沒有變色的最小藥物濃度即為該菌株對這種藥物的MIC[5, 7]。根據文獻，本實驗中Bdq和Dlm的耐藥臨界濃度分別設置為0.25 mg/L和0.06 mg/L[7-9]。

1.4統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行統計學處理。以卡方檢驗檢測各組之間差異，當n<5時，以fisher精確概率法進行統計分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1貝達喹啉及德拉馬尼的藥物敏感性 111株菌株均完成了Bdq藥敏檢測，有109株菌株完成了Dlm藥敏檢測。如表1中所示，對Bdq，大部分菌株的MIC都小于0.031 mg/L，MIC50和MIC90分別為0.016 mg/L和0.125 mg/L；對Dlm，大部分菌株的MIC小于0.016 mg/L，MIC50和MIC90分別為0.016 mg/L和0.063 mg/L。各有5株菌株對兩種藥物耐藥，Bdq的耐藥率為4.50%，Dlm的耐藥率為4.59%。

表1 Bdq和Dlm藥物敏感性情況Tab.1 Drug-susceptibility test for bedaquiline and delamanid in MDR-TB isolates

2.2貝達喹啉與其他藥物的耐藥相關性 111株MDR-TB菌株的比例法藥敏結果如表2所示。對Bdq的耐藥率以XDR-TB最高(8.00%)，其次為耐Pto的MDR-TB(7.89%)，最低的是pre-XDR-TB(2.00%)，但各組與MDR-TB菌株的Bdq耐藥率之間差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。5株Bdq耐藥株的耐藥譜如表4所示。

表2 MDR-TB菌株比例法藥物敏感性試驗結果Tab.2 Drug-susceptibility results of MDR-TB isolates by proportion method

表3 不同耐藥類型菌株的Bdq耐藥情況Tab.3 Drug-susceptibility of bedaquiline in different drug-resistant types

表4 貝達喹啉耐藥菌株的耐藥譜Tab.4 Drug-susceptibility profile of bedaquiline resistant isolates

* R，耐藥；S，敏感。

2.3德拉馬尼與其他藥物的耐藥相關性 109例MDR-TB菌株完成Dlm藥敏檢測，對Dlm的耐藥率以XDR最高(8.70%)，其次為耐Pto的MDR-TB(8.11%)，最低的是耐E+Sm的MDR-TB(3.45%)，各組與MDR-TB菌株的Dlm耐藥率之間差異無統計學意義(P>0.05)，見表5。5株Dlm耐藥株的耐藥譜如表6所示。

表5 不同耐藥類型菌株的德拉馬尼耐藥情況Tab.5 Drug-susceptibility of delamanid in different drug-resistant types

表6 德拉馬尼耐藥菌株的耐藥譜Tab.6 Drug-susceptibility profile of delamanid resistant isolates

* R，耐藥；S，敏感。

3 討 論

中國是結核病和耐藥結核病雙重高負擔國家，2018年估計有86.6萬新發及復發結核病例，其中6.6萬為MDR-TB或耐利福平結核(rifampin-resistant tuberculosis，RR-TB)[1]。貝達喹啉是一種二芳基喹啉類化合物，通過與MTB的ATP合成酶C亞基結合，抑制MTB的ATP合成，從而發揮抑菌和殺菌作用[10-11]。德拉馬尼屬于硝基咪唑類藥物，通過抑制分枝菌酸合成使MTB細胞壁合成受到抑制從而發揮作用[12]。目前認為這兩種新藥由于其作用機制與以往抗結核藥物不同，因而在耐藥結核病尤其是MDR-TB治療上有很好的應用前景[13]。在2019年WHO發布的耐藥結核病治療整合版指南中，Bdq和Dlm分別被列為MDR-TB治療的A組和C組藥物[14]。

迄今，有關Bdq和Dlm的可靠藥敏檢測體系仍未完全建立，目前研究多以MIC來描述其抗性[15]。在已有的研究中，不同地區的MTB對Bdq的MIC存在差異。在本研究中，大部分菌株對Bdq的MIC低于0.063 mg/L，與南非的結果、我國胡彥以及Pang等的研究結果一致，而與韓國研究中MIC主要處于0.125至0.25 mg/L不同[7, 16-18]。從本研究中Dlm的MIC分布上來看，大部分菌株對Dlm的MIC介于0.016 mg/L至0.063 mg/L之間，與韓國及我國Pang等的研究結果基本一致[7, 18]。造成這些差異的原因是否是由于各個地區流行菌株譜系的不同，還需要進一步的研究。

國外已有研究報道了Bdq和Dlm的獲得性耐藥和原發性耐藥，而這兩種藥物在我國剛獲得批準，尚未在臨床大規模使用，因此我們判斷本研究中的耐藥菌株應屬于原發耐藥[19-20]。2016年，胡彥等報道287株MDR-TB中，Bdq耐藥率為6.6%，且北京基因型菌株的耐藥率(4.6%)低于非北京基因型菌株的耐藥率(10.9%)[17]。而Pang等人對北京胸科醫院XDR-TB菌株的研究結果顯示，對Bdq的耐藥率為3.3%，對Dlm的耐藥率為4.4%[7]。韓國的研究顯示，420株MDR-TB和XDR-TB中，Bdq的耐藥率為11%，Dlm的耐藥率為10%[18]。在本研究中，Bdq和Dlm均表現出了很好的抗結核作用，檢出的耐藥率分別僅為4.50%和4.59%。研究結果顯示，重慶市MDR-TB的Bdq的耐藥率低于韓國的研究以及胡彥等的研究，但是與胡彥研究中北京基因型菌株的耐藥率非常接近[17-18]；同時，Dlm的耐藥率與Pang的研究結果接近，但低于韓國的研究結果[7, 18]。是流行菌株的不同還是不同地區菌株耐藥譜的不同造成了這些差異，仍需進一步研究。

在本研究中，盡管不同藥物耐藥組合類型的菌株對Bdq和Dlm的耐藥率之間并未表現出差異，但5株Bdq耐藥株均對4種一線藥(RIF、INH、Sm、EMB)全部耐藥，與胡彥的報道一致[17]。5株耐Dlm的菌株對5種抗結核藥物(R、H、E、Rft、Lfx)全部耐藥；10株Bdq和Dlm耐藥株均為pre-XDR或XDR，提示隨著耐受藥物的增多，菌株對Bdq和Dlm的敏感性有可能降低[17]。已有研究顯示，氯法齊明(Clo)與Bdq有交叉耐藥現象，而Clo已經運用于我國的TB治療中，是否是Clo的使用造成了Bdq的耐藥，尚需要進一步研究[21]。

本研究也存在一些不足：第一，樣本僅來源于一家結核病專科醫院，有可能導致結果的偏倚；第二，兩種藥物均為新的抗結核藥物，耐藥率低，導致檢出的耐藥株較少，降低了統計分析的可靠性，下一步仍需要更大樣本量的多中心研究。

通過本研究，我們初步明確了重慶市MDR-TB對Bdq和Dlm的藥敏MIC分布情況，結果表明重慶市大部分MDR-TB菌株對這兩種新的抗結核藥物非常敏感。同時我們也注意到，盡管這兩種藥物尚未在重慶投入臨床使用，但仍不應忽視原發耐藥，說明在制定臨床治療方案時，仍需重視對新藥的藥敏檢測。也許對醫生而言，面臨的最大挑戰是如何使用這些新藥來設計一種有效的方案，以防止TB對這些新藥物產生獲得性耐藥[22]。

利益沖突：無

引用本文格式：羅明，張匯征，嚴曉峰，等.重慶市耐多藥結核分枝桿菌對貝達喹啉和德拉馬尼的藥物敏感性研究[J].中國人獸共患病學報，2020，36(2)：100-104. DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.024