單核細胞增生李斯特菌感染對Bewo細胞炎癥因子及遷移能力的影響

朱昱蓉，史 倩，盧 葉，凌 薇，袁 琳，楊詩嫻，王蓓蕾，姜旭淦，陳盛霞

單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)簡稱單增李斯特菌，是一種革蘭陽性胞內寄生桿菌，在2000年被WHO列為四大食源性致病菌之一[1]。臨床上Lm感染率低，但致死率極高[2]。Lm可通過人體的3大屏障：血腦屏障，血腸屏障(腸道屏障)以及胎盤屏障，引起細菌性腦膜炎、細菌性腸胃炎、流產、死胎等疾病[1]。胎盤屏障主要由滋養層細胞、微血管內皮細胞以及兩者之間的基底膜構成，是藥物、病毒、細菌以及營養物質在胎兒與母體之間傳遞的必經之路[3]。其中，作為胎盤屏障第一道屏障的滋養層細胞直接與母體接觸，在胎盤屏障中起重要作用。滋養層細胞向子宮的適度遷移對正常妊娠的維持起重要作用。滋養層細胞遷移受嚴格的時空限制，細胞異常遷移與流產、子癇和胎兒異常生長等病理狀態的發生發展密切相關[4]，其中基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)在調控滋養層細胞的侵襲遷移過程中起重要作用[5]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)參與細胞的增殖、分化、凋亡、炎癥和轉化等生理過程[6-8]，是胞內外轉導的關鍵環節，主要包括p38MAPK、ERK1/2及JNK等3條通路。研究表明，MAPK家族在胎盤屏障抵御外界病原體感染以及調控MMPs[9]的表達中發揮著重要作用。本文以胎盤滋養層細胞系Bewo細胞為模型，研究Lm感染引起滋養層細胞相關炎癥反應及其對滋養層細胞遷移能力、遷移相關蛋白的影響，并對其機制進行研究，為Lm感染所致的流產等疾病提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1細胞與菌株 實驗用單核細胞增生李斯特菌EGD株由天津醫科大學申艷娜博士惠贈，胎盤滋養層細胞Bewo細胞購自中國典型培養物保藏中心(CCTCC)(武漢)。

1.1.2主要試劑 胎牛血清和F12-K培養基購自Gibco，腦心浸出液肉湯(BHI)購自北京路橋技術股份有限公司，PCR引物由上海生工合成，Trizol、逆轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑均購自南京Vazyme公司，MMP2、MMP9抗體購自美國CST公司，p38MAPK、p-p38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、TIMP-1抗體購自萬類生物，HRP標記的羊抗兔二抗、HRP標記的羊抗鼠二抗購自康為世紀，ECL顯色液購自Millipore公司。

1.1.3主要儀器 二氧化碳細胞培養箱購自美國Thermofisher公司，恒溫空氣浴搖床購自福瑪公司，普通PCR儀購自天能公司，熒光定量PCR儀購自美國ABI StepOnePlus公司， Western Blot電泳儀購自美國BioRad公司，Imge Quant LAS 4000 mini購自美國GE公司。

1.2 方 法

1.2.1Lm及Bewo細胞的培養 Lm接種于BHI培養液中，37 ℃ 250 r/min恒溫空氣浴搖床過夜培養。Bewo細胞接種于細胞培養瓶中，用含10%胎牛血清的F12-K培養基培養于37 ℃ 5% CO2培養箱中，4～5 d傳代1次，傳代時用含EDTA的0.25%胰酶消化5 min。

1.2.2Bewo細胞炎癥因子檢測 采用熒光定量PCR SYBR green法進行檢測，相關引物序列見表1。Bewo細胞以5×105/孔接種于6孔板中，將過夜培養的Lm用滅菌PBS清洗2遍，調整至OD600=1.000(109CFU/mL)，以感染復數(multiplieity of infection，MOI)=10感染Bewo細胞，共孵育1 h后加入慶大霉素殺滅細胞外細菌，殺菌0.5 h后換無抗生素的培養液培養。以加入細菌為計時起點，收集Lm感染1 h、3 h、6 h、12 h的細胞，用Trizol法提取RNA，逆轉錄成cDNA，實時熒光定量PCR法(qRT-PCR)檢測IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平。結果分析采用相對定量分析方法，根據2-△△Ct值來確定基因的相對表達量。所有標本設置3個復孔并進行3次獨立重復實驗。

表1 炎癥因子及MMP2轉錄水平檢測用qRT-PCR引物Tab.1 Primers for qRT-PCR to detect the expression of inflammatory cytokines and MMP2

1.2.3Bweo細胞遷移能力的檢測 劃痕試驗，六孔板中接種106個/孔細胞，次日，以MOI=10 Lm感染Bewo細胞。共孵育1 h后，用10 μL槍頭垂直劃線，PBS清洗3次，以去除漂浮細胞。以此時為計時起點，在0 h、6 h、9 h、12 h用倒置顯微鏡觀察并拍照。Transwell試驗，同1.2.2操作獲得Lm感染的Bewo細胞，收集Bewo細胞，以無血清F12-K培養液重懸至5×105/mL。在小室上室接種200 μL Bewo細胞懸液，下室加30% F12-K培養液，培養24 h后取出小室，用4%多聚甲醛室溫固定細胞，結晶紫染色，顯微鏡觀察并拍照。Image-Pro Plus軟件測量劃痕寬度并計數小室細胞數。每組設置3個復孔并進行3次獨立重復實驗。

1.2.4Lm感染所致Bewo細胞功能改變的相關機制 同1.2.2操作方法收集Lm感染的Bewo細胞，常規方法提取細胞總蛋白，將各樣本蛋白濃度調整一致后，用12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，然后350 mA、90 min將蛋白轉印至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗4 ℃過夜孵育后，TBST洗膜，HRP標記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后ECL顯色，檢測遷移相關蛋白MMP2、MMP9、TIMP-1的表達，以及MAPK家族蛋白p38MAPK及ERK1/2的表達及活化水平的變化。同時，用qRT-PCR檢測MMP2轉錄水平的變化(引物見表1)。Image-Pro Plus軟件進行蛋白灰度掃描分析。實驗均進行3次獨立重復實驗。

1.2.5統計學分析 用GraphPad Prism6進行統計分析，兩組間比較采用t檢驗(student’s test)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1Bewo細胞炎癥因子mRNA水平的改變 用qRT-PCR法檢測Lm感染Bewo細胞1 h、3 h、6 h、12 h炎癥因子(圖1)，結果表明，隨著感染時間的延長，炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平與1 h相比均增高，且均在3 h mRNA水平最高。

A: mRNA expression of IL-1β, B: mRNA expression of IL-6, C: mRNA expression of TNF-α;(*P<0.05)圖1 Lm感染Bewo細胞炎癥因子轉錄水平的變化Fig.1 Transcription levels of inflammatory cytokines in Bewo infected by Listeria monocytogenes

2.2Bewo細胞遷移能力的變化 用劃痕試驗和Transwell試驗檢測Lm感染Bewo細胞后對細胞遷移能力的改變，結果顯示，Lm感染Bewo細胞后，劃痕寬度隨著時間延長變窄；Transwell試驗結果顯示Lm感染之后穿過小室的細胞增多，細胞的遷移能力增強(圖2)。

A: Wounding healing-0 h, B: Wounding healing-3 h, C: Wounding healing-6 h, D: Wounding healing-12 h, E: Scratch width, F: Transwell-Control, G: Transwell-MOI=10, H: Count of migration results;(*P<0.05)圖2 Lm感染Bewo后遷移能力的變化Fig.2 Changes in migration ability of Bewo infected by Listeria monocytogenes

2.3Lm感染Bewo細胞MMPs的改變 Western Blot結果表明，隨著Lm感染時間延長，MMP2蛋白水平升高；MMP9和TIMP-1表達水平先上升，隨后下降(圖3 A)。qRT-PCR檢測MMP2在mRNA水平的變化，結果顯示MMP2的mRNA水平先下降后上升(圖3B)。

A: Protein expression of MMPs, B: mRNA expression of MMP2; (*P<0.05)圖3 Lm感染Bewo細胞MMPs表達水平Fig.3 The expression levels of MMPs proteins in Bewo infected by Listeria monocytogenes

2.4Lm感染所致Bewo細胞功能改變的機制 Western Blot結果顯示(圖4)，隨著Lm感染時間的延長，p38MAPK及ERK1/2蛋白磷酸化的水平發生改變，p38MAPK隨著感染時間的延長逐漸被激活，磷酸化水平呈上升趨勢；ERK1/2隨著感染時間的延長，磷酸化水平升高，在感染3 h達到高峰后稍有下降。

3 討 論

Lm作為胞內寄生菌，可穿越機體3大屏障而致病[10-12]。雖然Lm感染率低，但致死率極高[13]，因此對Lm致病機制的研究尤為重要。本研究主要探討Lm感染對胎盤屏障的影響。胎盤屏障[14]是多種物質從母體進入胎兒的必經之路，其中滋養層細胞為屏障的最外層，在胎盤的形成、抵抗病原微生物的入侵以及妊娠識別都具有重要的作用[2]。 Bewo細胞的形態學特性和生化指標均與正常滋養細胞相同，Bewo 細胞作為體外模型常應用于滋養細胞功能的研究[15-16]。因此，本研究選用Bewo細胞為滋養層細胞模型，研究Lm感染與滋養層細胞之間的關系。

本研究發現，Lm感染Bewo細胞激活了炎癥反應，細菌感染相關的炎癥因子轉錄水平上調，與其他研究報道一致[11]。IL-1β、TNF-α、IL-6在細菌感染之后相繼被激活，表明Lm成功感染Bewo細胞并產生抗感染免疫反應。有研究表明[17]，外界病原體刺激胎盤相關細胞時，IL-6水平上升會導致流產，這提示單增李斯特菌感染所致的流產可能與炎癥因子水平的升高相關，滋養層細胞可能參與炎癥致流產的過程。我們通過劃痕試驗及Transwell試驗發現，Lm感染會導致Bewo細胞遷移能力增強；Western Blot結果表明，Lm感染對Bewo細胞遷移能力的影響主要是由滋養層細胞基質金屬蛋白酶MMP2、MMP9及相關的組織型基質金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1的變化所致。Lm感染導致Bewo細胞遷移能力增強，MMP2水平升高，MMP9水平先上升后稍有下降，說明MMP2在Lm感染引起的Bewo細胞遷移能力改變中發揮著重要作用；表達和分泌MMP9 的細胞可能是滋養層細胞以外的一些其他類型的細胞，如基質細胞、巨噬細胞等[18-20]。

A: Protein expression of p-p38MAPK, p38MAPK; B: Protein expression of p-ERT1/2, ERK1/2;(*P<0.05)圖4 Lm感染Bewo細胞 p38MAPK、ERK1/2表達水平的變化Fig.4 Expression levels of p38MAPK、ERK1/2 in Bewo infected by Listeria monocytogenes

已有研究表明，MAPK家族蛋白p38MAPK及ERK1/2參與抗感染免疫的發生并對細胞侵襲遷移能力具有調控作用[21]。因此我們檢測了MAPK家族p38MAPK及ERK1/2活化水平，結果表明Bewo細胞在Lm感染后p38MAPK及ERK1/2被不同程度的激活。我們推測MMP9在6 h和9 h的改變可與ERK1/2通路的激活相關，這與陳升平等[19]的報道一致。

綜上所述，Lm感染Bewo細胞導致Bewo細胞炎癥反應的發生，細胞p38MAPK及ERK1/2通路被激活，同時基質金屬蛋白酶的表達亦增高，Bewo細胞遷移功能增強。我們推測Lm感染激活Bewo細胞炎癥反應以及細胞遷移能力的變化可能是通過p38MAPK及ERK1/2通路實現的，但p38MAPK以及ERK1/2在Lm感染所致Bewo細胞炎癥因子及遷移能力變化中的具體作用仍需進一步研究。本研究為進一步明確Lm的致病機制、開發有效的預防治療藥物奠定了基礎。

利益沖突：無

引用本文格式：朱昱蓉，史倩，盧葉，等.單核細胞增生李斯特菌感染對Bewo細胞炎癥因子及遷移能力的影響[J].中國人獸共患病學報，2020，36(2)：94-99. DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.032