弓形蟲Chinese 1基因型Wh6弱毒株感染小鼠抗強毒株致死性感染的免疫保護作用

陳守斌，何佳麗，崔 雯，王 聰，陶 晴,計永勝,羅慶禮，胡曉東，沈繼龍，王 維

弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種機會致病性寄生原蟲，引起人獸共患弓形蟲病[1]。弓形蟲三種基因分型I型、II型和III型，II型蟲株PRU株在歐洲、北美和非洲流行區占主導地位[2]。Chinese 1基因型包括I型Wh3型和II型Wh6型，是中國流行區的優勢基因型[3-6]，我們自貓體內分離出了該基因型的兩個蟲株Wh3和Wh6,WH3株和WH6株是毒力截然不同的二個蟲株，前者感染后小鼠在第8 d全部死亡，故為強毒株，而Wh6蟲株感染后30d內未見小鼠死亡，存活小鼠的腦組織內僅見少量包囊，屬于弱毒株[7-8]。

弓形蟲病是食源性寄生蟲病，多數動物因食入被包囊，卵囊污染的食物而感染。在自然界，人和各種動物可能發生不同蟲株或亞型的弓形蟲重復感染，使宿主產生帶蟲免疫，可誘導免疫保護性[9]，從而部分抑制或完全抵抗另一蟲株的入侵。中國優勢基因型的2個不同毒力蟲株交叉感染的保護性免疫作用的研究未見報道。為了探討Wh6弱毒蟲株感染后是否可誘導有效的抗再感染的免疫保護力，從而為經射線或化學致弱的活蟲疫苗的研究奠定基礎，本課題首先利用Chinese 1基因型Wh6株初次感染BALB/c小鼠，35d后建立慢性感染模型。其后用致死劑量的Wh3株速殖子攻擊感染，攻擊感染后，觀察各組小鼠存活率、腹腔蟲荷、脾細胞分泌Th1和Th2細胞因子水平，旨在探討相同基因型不同毒力蟲株誘導的免疫保護力，并為致弱的活蟲疫苗研發提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1試劑 青霉素，鏈霉素，離子霉素(Sigma，USA)，Dulbecco改良的Eagle培養基，胎牛血清(FBS)和Roswell Park Memorial Institute 1640培養基(RPMI 1640)(Montreal, QC, Canada)。 Brefeldin A，佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯，FITC標記的抗小鼠CD3+抗體，FITC標記的抗小鼠CD4+抗體，PE標記的抗小鼠CD8+抗體，APC標記的抗小鼠IL-4抗體，Percp-cy5.5 標記的抗小鼠IFN-γ抗體，APC標記的抗小鼠CD25+抗體，(紐約，BD，USA)。IL-10和IL-12ELISA試劑盒購自R&D Systems(Minneapolis，MN，USA)。

1.1.2弓形蟲蟲株 Chinese1基因型的Wh6和Wh3兩個蟲株分離自流浪貓，成囊型的Wh6弱(無)毒株和Wh3強毒株均分別經小鼠接種傳代保種和低溫凍存[3]。將凍存的Wh3速殖子37 ℃水浴復蘇，計數后注射到昆明小鼠腹腔內，穩定傳代3代以上獲得的速殖子分別用于實驗鼠的慢性感染和攻擊感染。無痛取Wh6株弓形蟲保種3個月以上的昆明小鼠腦組織，生理鹽水中無菌輕輕碾磨，制備混懸液，顯微鏡下計數包囊，用于實驗鼠的灌胃感染。Wh3株蟲體的制備同上，接種小鼠3 d后無痛處死，自腹腔液中分離速殖子，計數備用。

1.1.3實驗動物 雌性BALB/c小鼠級別為SPF級，49～56 d齡，體重范圍是20～25 g，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司；雌性的昆明小鼠級別為潔凈級，6～8周齡，體重范圍為20～25 g，購自安徽省實驗動物中心。

1.2 方 法

1.2.1小鼠模型的建立 6周齡雌性昆明小鼠和6～8周齡的雌性BALB/c獲自安徽醫科大學實驗動物中心。在標準條件下給小鼠自由飲水和進食。嚴格按照安徽醫科大學動物中心生物醫學研究所的機構審查委員會制定的倫理標準(許可證號：AMU26-081108)遵循所有程序。在昆明鼠體內進行弓形蟲包囊傳代及保種，小鼠適應新環境1周后，將BALB/c鼠隨機分成3組，每組10只動物。選取一組BALB/c鼠口服灌胃25～35個Wh6包囊(I組)，包囊來自感染3個月以上的昆明小鼠腦組織勻漿。另外兩組，一組使用等量PBS灌胃處理(II組)，另一組不做任何處理(III組)作為正常對照。在感染后35 d，第I、II組用3 000個Wh3速殖子腹腔攻擊感染。在Wh3速殖子感染后1周處死，收集3組小鼠的組織標本。

1.2.2制備單細胞懸液 分別將3組試驗小鼠的脾臟無菌取出，置于200目鐵濾網，加入適量的PBS，并用注射器針蕊輕輕研磨。將細胞懸液移到15 mL離心管中，并加滿PBS。經2 500 r/min 4 ℃離心5 min，棄去上層PBS液；加入3 mL紅細胞裂解液混勻，并置于4 ℃的冰箱中裂解10 min，在離心管加滿PBS溶液，以2 000 r/min 4 ℃離心5 min。棄去上層PBS液，加入1 mL PBS溶液重懸定容。

1.2.3流式細胞術分析 將1 mL 10%FBS的RPMI 1640培養基加入24孔細胞培養板中，將計數后的脾細胞懸浮液加入板中(細胞數為1×106/ mL)。用于細胞內細胞因子染色，加入布雷菲德菌素A(1 mg/mL)、離子霉素(1 mg/mL)和PMA(20 ng/mL)刺激細胞5 h。一組細胞用FITC標記的抗小鼠CD4+抗體在4 ℃孵育30 min，另一組用FITC標記的抗小鼠CD3+和PE標記的抗小鼠CD8+抗體在4 ℃避光孵育30 min，并洗滌2次，根據廠家說明用Cytofix/Cytoperm試劑盒固定；加入Percp-cy5.5標記的抗小鼠IFN-γ和APC標記的抗小鼠IL-4抗體 4 ℃避光孵育30 min。洗滌后，加入細胞固定劑并在流式細胞儀上機檢測。

1.2.4RNA提取和q-PCR 小鼠脾組織用TRIzol(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)裂解，并按照制造商說明使用Takara Kit(Takara，Japan)轉錄成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(Takara，Japan)通過Light Cycler 480進行定量分析，以檢測IFN-γ、IL-12和IL-10的表達。使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為標準對照。用公式2-ΔΔCt比較ΔCt方法計算相對mRNA表達水平。所有引物見表1。實驗重復3次。

表1 細胞因子引物序列Tab.1 Primer squences of cytokines detected by q-PCR

1.2.5酶聯免疫吸附試驗 將含有10%FBS的1 mL RPMI 1640培養基加入24孔板中培養脾細胞，每孔2×106個細胞，用離子霉素(1 mg/mL)和PMA(20 ng/mL)刺激脾細胞5 h。通過離心收獲細胞上清液，ELISA檢測IL-10和IL-12含量。每組設置3個重復孔。使用酶標儀(Biotek，Winooski，VT，USA)在450 nm下測量吸光度。

2 結 果

2.1強毒株Wh3攻擊感染后小鼠的生存狀況 初次攻擊感染(Wh6株包囊)后35 d，所有小鼠存活。無痛剖殺小鼠取腦組織壓片，鏡檢查見具有完整囊壁的圓形包囊，內含緩殖子(圖1)，表明慢性感染BALB/c鼠模型建立成功。在Wh3株速殖子攻擊感染后第3～4 d時，I組小鼠出現一過性急性感染癥狀，表現為弓背、毛發豎立，隨后癥狀逐漸減輕。1周后所有攻擊感染鼠恢復正常，繼續存活直至實驗結束。同期PBS實驗對照的II組小鼠在Wh3感染后第3～4 d時，出現弓背豎毛的癥狀，隨天數增加癥狀逐漸加重，在第7 d內死亡5只小鼠，剩余小鼠在第8 d凌晨全部死亡(圖2)。

圖1 普通光學顯微鏡下觀察，Wh6株感染后35 d，BALB/c鼠腦組織壓片中典型弓形蟲包囊Fig.1 Optical microscopy appearance of brain tissue cysts in infected BALB/c mice with Wh6 stain of Toxoplasma gondii on day 35 post infection

圖2 25-35個Wh6株包囊感染后42 d后，I組(藍色)、II組(綠色)和III組(紅色)BALB/c鼠存活狀況Fig.2 At42 days postinfection, percent survival of Group I (Blue), Group II (Green) and Group III (Red) mice orally attacked with 25-35 T.gondii Wh6 strain cysts.The combined results of two experiments are shown (n=10)

2.2小鼠腹腔內速殖子計數 使用2 mL無菌生理鹽水灌洗小鼠腹腔，鏡下進行腹腔灌洗液速殖子計數。Wh3株攻擊感染后第7 d，隨機取3只II組小鼠進行腹腔蟲荷計數，腹腔速殖子計數為1.28±0.0351×106/mL，而I組感染免疫小鼠Wh3株攻擊感染后，腹腔灌洗液未查見速殖子。

2.3小鼠脾細胞上清液和脾組織中IFN-γ、IL-10和IL-12水平 為進一步探討慢性弓形蟲感染小鼠對強毒Wh3株攻擊感染的免疫應答，在二次攻擊感染后第8 d，剖殺各組全部的小鼠，取脾臟制成脾細胞懸液，培養收集上清，q-PCR和ELISA分別檢測脾細胞上清液和脾組織IFN-γ、IL-10和IL-12水平。q-PCR結果顯示，II組小鼠脾細胞中IFN-γ、IL-10和IL-12水平較I組、III組升高(F=719.1，P<0.001)；I組動物的IFN-γ、IL-10和IL-12細胞因子水平低于II組(F=432.2，P<0.001)，但高于正常組(F=67.47，P<0.001)(圖3)。

與q-PCR結果一致，ELISA結果顯示，II組鼠IL-10和IL-12水平較I組、III組升高(F=38.79，P<0.05)。I組小鼠的IL-10、IL-12水平仍高于正常組(F=87.34，P<0.01)(圖4)。

* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001圖3 q-PCR分別檢測I組、II組和III組鼠脾組織IFN-γ、IL-12和IL-10水平Fig.3 Levels of IFN-γ, IL-12 and IL-10 in the spleen tissues of Group I, Group II and Group III were detected by q-PCR

* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001圖4 ELISA檢測I組、II組III組鼠脾細胞上清IL-10和IL-12的水平(pg/mL)Fig.4 Levels of IL-10 and IL-12 (pg/mL) in the cultured splenocyte suspensions of Group I, Group II and Group III were determined by ELISA

2.4小鼠脾CD4+T細胞IFN-γ和IL-4表達 分離和培養原代脾細胞，流式細胞術檢測IFN-γ和IL-4的水平，分析結果顯示II組鼠IFN-γ和IL-4增高。I組小鼠IFN-γ和IL-4相比于II組表達降低，且低于正常組的水平(F=10.96,7.86；P<0.05)。見圖5。

3 討 論

弓形蟲病最常見的感染方式是通過攝入含有包囊的食物和水[20]。在小腸中，從包囊中釋放的緩殖子，轉化為速殖子并在組織中繁殖。在免疫功能正常的機體，感染的宿主可以抑制蟲體的增殖，蟲體在腦組織和肌肉組織內形成包囊，宿主呈隱性或慢性感染狀態。在艾滋病，腫瘤和器官移植等免疫功能低下的患者[10-11]，隱性感染的包囊可被激活，包囊破裂，蟲體釋出，引起弓形蟲腦炎或全身播散性弓形蟲病等嚴重后果。研究表明，穿孔素(profilin)介導的CD8+T細胞活化可在此階段從腦中除去繁殖階段寄生蟲[12]。已知宿主固有免疫和適應性免疫應答中經典途徑活化的巨噬細胞(M1)分泌的IL-12以及NK、Th1等分泌的IFN-γ在宿主抗弓形蟲免疫應答中發揮關鍵作用。Wh6株攜帶致密顆粒蛋白GRA15II，在急性感染階段可直接激活NF-κB，誘導M1的活化[13]。M1的極化可有效啟動Th1型適應性免疫應答。感染誘導的免疫力可以通過上調小鼠細胞免疫相關GTP酶(immunity-related GTPaseIRGs)，IRG在PVM上累積，導致PVM破裂和弓形蟲裂解[14]。細胞中的病原體也可通過觸發呼吸爆發和釋放一氧化氮(NO)而被殺滅。

弓形蟲至今尚無有效的防治藥物，安全有效的疫苗是防治弓形蟲病的策略之一，弓形蟲疫苗的研發經歷了活疫苗、減毒活疫苗、滅毒疫苗、蛋白疫苗、核酸疫苗等幾個階段。滅活疫苗、蛋白疫苗和核酸疫苗都有一定的干預作用，但存在返毒現象和缺乏有效保護力等問題[15-17]。減毒活疫苗是將病原體經過人工處理，雖然大大降低其致病性，但仍可能存在一定致病性和免疫原性等問題。利用弓形蟲速殖子制成的弱毒活疫苗可以誘發機體產生與天然主動免疫相似的免疫應答，其免疫效果強于滅活疫苗[18]。

* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001圖5 流式細胞術檢測I組、II組和III鼠原代脾細胞中CD4+T細胞INF-γ和IL-4水平(%)Fig.5 At 42 days postinfection,level of INF-γ and IL-4 in primary splenocyte CD4+ Tcells from mice in Group I, Group II and Group III detected by Flow cytometry, respectively

S48株是從流產的羊體內分離出來，速殖子在小鼠體內經過多次傳代，失去了形成包囊的能力[19-20]。用減毒活疫苗S48免疫羊后可以明顯減少其體內的弓形蟲數量，現已在動物體內推廣使用[21]。理想活蟲疫苗不僅能夠刺激機體產生有效保護性，而且不具備在體內增殖和播散能力。近年Fox等研發出一株尿嘧啶營養缺陷型非復制型II型蟲株的減毒活疫苗，接種小鼠后既無毒力，在體內也不成囊，因此無引起慢性感染的安全性問題。此外，該疫苗可誘導小鼠產生抗強毒I型或弱毒II型蟲株急性感染的完全的保護力，有望成為基因改造的活蟲疫苗[22]。Wh6蟲株是從我國流浪貓體內分離而獲得，屬于Chinese 1型的弱(無)毒株，對感染動物僅有輕微的致病作用。實驗動物常呈一過性自愈的慢性感染，并且成囊數量較少。而且Chinese 1型蟲株具有ROP16I/ III和GRA15II多態性。在感染孕鼠模型中，雖然Wh3蟲株和Wh6蟲株都能夠誘導孕鼠滋養層細胞凋亡，但是其母胎界面免疫極化機制不同，Wh3蟲株誘導巨噬細胞M2/Th2方向極化。而Wh6蟲株誘導巨噬細胞向M1/Th1方向極化[4,23-25]。鑒于Wh6蟲株這些特性，因而具有成為候選活蟲減毒疫苗蟲株的潛在應用價值。

本研究結果顯示，弱毒株Wh6感染的機體可抵抗強毒株Wh3致死性入侵，推測與下列因素有關：1)蟲株Wh6毒力弱，Wh6蟲株誘導巨噬細胞向M1/Th1方向極化[4,23-25]，致密顆粒蛋白GRA15II 和Profilin是重要的免疫誘導因子，可在急慢性感染階段有效驅動M1-Th1型應答[13,26]；2)相比較正常小鼠體內IFN-γ水平，活蟲感染能夠刺激機體較長時間持續產生相對較高的IFN-γ水平。有文獻報道弓形蟲慢性感染的小鼠能使小鼠體抵抗李斯特菌等細菌的致死性感染[27]；3)Wh6與強毒株Wh3同屬于Chinese 1基因型，具有良好的交叉免疫保護性。

弓形蟲感染小鼠體內免疫應答，細胞因子表達水平是動態變化的，與不同感染時間有關，IFN-γ的表達水平在感染1月后呈下降趨勢[28]。本研究結果顯示，在攻擊感染后期，I組小鼠Th1細胞因子IFN-γ明顯低于II感染組小鼠但高于正常對照組。推測其原因，第一，Wh6株慢性感染的小鼠體內CD4+CD25+的細胞群的比例上升[29]，流式檢測結果中，I組小鼠攻擊感染后，CD4+T表達IFN-γ不僅低于II感染組小鼠也低于正常對照組，但是I組小鼠體內IFN-γ總水平是高于正常對照小鼠的，可能是IFN-γ的分泌不只是來源于CD4+T細胞。第二，BALB/c鼠在慢性感染過程中，可能產生對Th1細胞因子的免疫抑制作用[29]，因為Wh6具有ROP16I/ III和GRA15II多態性，Wh6蟲株雖然結局上誘導巨噬細胞向M1/Th1方向極化，但ROP16I/ III可能依然起作用，會抑制Th1細胞因子的分泌[30-31]。過高水平的Th1炎性因子也可能對小鼠造成病理損傷，甚至導致小鼠死亡，本研究中Wh3攻擊感染，抑制了過高水平的IFN-γ的產生，間接發揮了免疫保護作用，使得小鼠不會死于過高水平的Th1炎性因子[32-33]。綜上所述，Wh6株感染小鼠，可能獲得了對Th1細胞因子的免疫抑制性，在Wh3株急性攻擊感染小鼠時，避免產生急劇的Th1細胞因子水平的上升，超過小鼠自身耐受，達到致死性水平。但是Th1細胞因子總體水平與正常小鼠相比是上升的，使得小鼠可以清除體內的速殖子，控制了速殖子的繁殖，讓小鼠成功的存活下來。

利益沖突：無

引用本文格式：陳守斌，何佳麗，崔雯，等.弓形蟲Chinese 1基因型Wh6弱毒株感染小鼠抗強毒株致死性感染的免疫保護作用[J].中國人獸共患病學報，2020，36(2)：87-93. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.013