卵巢切除手術對大鼠骨質(zhì)的影響

鄧 琳，馮倩倩，凌 斌★，馮定慶

（1.中日友好醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100029；2.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院 研究生院，北京 100730）

圖1 卵巢去勢對大鼠腰椎骨組織結(jié)構(gòu)的影響。1A：對照組腰椎，可見完整的骨小梁結(jié)構(gòu)（HE×100）；1B：去勢組腰椎,骨小梁斷裂，出現(xiàn)多個游離端（HE×100）；1C：對照組骨小梁結(jié)構(gòu)完整，小梁內(nèi)可見綠色膠原纖維（Masson染色×100）；1D：去勢組可見骨小梁斷裂、間距增寬、殘端游離，少見膠原纖維（Masson染色×100）。

建立動物骨質(zhì)疏松模型主要有藥物和去勢手術， 應用卵巢去勢方法建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型是目前常用的研究方法[1]，動物來源一般為SD 大鼠， 但至今為止國內(nèi)外對于大鼠骨質(zhì)疏松模型的判定和評價標準尚不統(tǒng)一[2，3]。 本研究對SD 大鼠進行卵巢去勢手術，測定大鼠的骨密度、骨代謝指標、動情周期和骨小梁結(jié)構(gòu)，以期從多方面為大鼠骨質(zhì)疏松的評判提供一些依據(jù)和參考。

1 研究方法

1.1 實驗動物飼養(yǎng)

6月齡雌性未孕Sprague Dawley（SD）大鼠16只，體質(zhì)量450±20g，購自北京華阜康實驗動物中心，許可證號：scxk（京）2014-0004。動物飼養(yǎng)于中日友好臨床醫(yī)學研究所SPF 動物室， 室溫22℃～26℃，濕度40%～60%，每12h 進行晝夜明暗交替，自由飲水和采食。 分籠飼養(yǎng)，每籠4 只大鼠，適應環(huán)境2 周后開始實驗。 本研究已取得中日友好臨床醫(yī)學研究所動物實驗倫理批件 （倫理審批號：180203）。

1.2 SD 大鼠去勢模型的建立

大鼠2 周適應環(huán)境后隨機分為對照組和去勢組，每組8 只。 去勢組：10%水合氯醛按400mg/kg腹腔注射麻醉。腹部正中切口，結(jié)扎卵巢周圍血管后切除雙側(cè)卵巢，碘伏消毒，逐層縫合[4]。肌注青霉素20 萬U/只。 對照組步驟同去勢組， 不切除卵巢，僅切除卵巢周圍同等大小的脂肪組織。

1.3 大鼠血清骨轉(zhuǎn)換標志物水平測定

大鼠去勢2 周后，予陰道分泌物檢測，待去勢組失去節(jié)律性動情周期后予血清股轉(zhuǎn)換標志物檢測， 每2 周檢測1 次。 10%水合氯醛按400mg/kg腹腔注射麻醉，備皮并消毒心臟所在區(qū)域皮膚，觸及心臟搏動最強點后固定， 垂直進針回血后抽取動脈血1ml。 消毒抽血部位皮膚并按壓數(shù)秒止血。于3000rpm/min 下離心5min，收取上清，分裝備用，保存于-80℃冰箱保存。 ELISA 試劑盒購自云克隆公司， 根據(jù)說明稀釋血清并用酶聯(lián)免疫法測定血清血清I 型原膠原氨基端前肽（procollagen type I N-terminal propeptide， PINP）、骨鈣素（osteocalcin，OC） 和I 型膠原交聯(lián)羧基端肽 （crosslinked carboxy-terminal telopeptide of I collagen，I-CTX）水平。

1.4 大鼠骨密度的測定

術后4周起， 每2周測量1次大鼠骨密度（bone mineral density，BMD）。 10%水合氯醛按400mg/kg 腹腔注射麻醉。 將大鼠俯臥位固定在雙能X 線骨密度測量儀（dual energy X-ray absorptiometry， DXA，美國GE 公司）的掃描定位板上，用系統(tǒng)自帶的小動物測量軟件勾選目標區(qū)域后測定活體腰椎和雙側(cè)股骨的BMD。按照人骨質(zhì)疏松判斷標準[5]評定。

1.5 根據(jù)大鼠陰道脫落細胞觀察動情周期

術后2 周起每日同一時間對去勢組和對照組大鼠逐只進行陰道涂片觀察。 將大鼠糞便及尿液擦凈， 用沾有生理鹽水的小棉簽輕輕插入大鼠陰道取黏液，均勻涂在載玻片上，固定后HE 染色，中性樹膠封片。 顯微鏡下觀察。

1.6 骨組織切片染色

大鼠于去勢3個月后處死， 取腰椎固定于10%福爾馬林溶液中，1 周后取出，置于含硝酸的混合脫鈣液中脫鈣2 周。修剪組織到合適大小，標記后常規(guī)乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，使用多聚賴氨酸溶液浸泡過的載玻片， 切片厚5μm。 Masson 染色觀察骨組織中膠原纖維水平。HE 染色觀察骨小梁結(jié)構(gòu)， 進行骨組織形態(tài)計量學參數(shù)的測定。應用ImageProPlus 顯微測量系統(tǒng)，測定總組織面積（T.Ar）、骨小梁面積（Tb.Ar）和骨小梁周長（Tb.Pm）。 并用校正公式進行計算。

1.7 統(tǒng)計學方法

應用SPSS22.0 和GraphPadPrism 7.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及作圖。正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 動情周期的觀測

對照組大鼠呈現(xiàn)規(guī)律的動情前期-動情期-動情后期-動情間期的周期變化。 動情前期 （2～3d）：多為橢圓形有核上皮細胞，偶有少量角化細胞；動情期（1～2d）：多為外形不規(guī)則的角化上皮細胞，常相互連接成片或呈“落葉狀”堆積；動情后期（2～3d）：不規(guī)則角化上皮細胞，有核上皮細胞，白細胞均可見，均勻分布；動情間期（3～9d）：多為白細胞，偶有少量有核上皮細胞和少量黏液。術后第9 周起，去勢組大鼠即表現(xiàn)為沒有動情期，以動情間期為主，動情前期-動情間期交替的變化，失去正常的動情周期節(jié)律。

2.2 骨密度的測定

自術后6 周起，去勢組大鼠較對照組BMD 呈降低趨勢，差異無統(tǒng)計學意義。 術后10 周，如表1所示，去勢組腰椎及股骨BMD 較對照組均降低，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），其中腰椎變化較股骨更為突出（表1）。去勢組大鼠腰椎BMD 與對照組比較， 降低20.4%，＞20%（P＜0.05）； 股骨BMD 降低11%（P＜0.05），其中右側(cè)股骨降低較左側(cè)更顯著，為12.3%（P＜0.05）左側(cè)股骨BMD 降低10.1%。根據(jù)BMD 計算T 值，大鼠腰椎T 值-2.58，＜-2.5，已達到骨質(zhì)疏松水平。 股骨T 值為-2.17，其中右側(cè)股骨T 值為-4.95， 達到骨質(zhì)疏松水平，左側(cè)股骨T 值為-1.15，為骨量減低。

表1 對照組和去勢組大鼠腰椎、股骨骨密度（g/cm2）

表2 卵巢去勢對大鼠血清骨轉(zhuǎn)換標志物水平的影響

2.3 骨轉(zhuǎn)換指標的測定

每月測量大鼠血清PINP、OC、I-CTX的水平。 表2 示，術后3個月，去勢組大鼠血清OC 的水平為529.5±19.29pg/ml，較對照組顯著降低（P＜0.01）； 去勢組大鼠血清I-CTX 的水平為144.1±1.44pg/ml，較對照組顯著升高（P＜0.01）；大鼠血清PINP 的水平為3310±216.4pg/ml， 較對照組有所降低（P＞0.05）。

2.4 骨組織切片染色

術后3個月，處死大鼠，取腰椎切片做HE 和masson 染色（圖1A～1D，封二）。 對照組骨小梁結(jié)構(gòu)完整，致密，相互連接成立體網(wǎng)狀，少見游離端，骨小梁表面光滑，間距小，且骨小梁內(nèi)可見綠色的膠原纖維；去勢組骨小梁結(jié)構(gòu)松散，排列稀疏，骨小梁間距明顯增寬，厚度減低，形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)斷裂、殘端游離，連接中斷，失去正常骨小梁的三維結(jié)構(gòu)，亦少見綠染的膠原纖維。對照組骨小梁百分率為32.07%±1.44%， 去勢組則為15.31%±0.63%，較對照組有明顯減低（P＜0.01）（圖2A）。對照組骨小梁厚度為68.41± 3.19μm， 與對照組（52.28±0.81μm）相比顯著減低（P＜0.01）（圖2B）。對照組骨小梁間距為144.5±4.74μm，去勢組則為289.7±13.35μm，與對照組相比去勢組骨小梁間距顯著增寬，達對照組的2 倍（P＜0.01）（圖2C）。

3 討論

本實驗選擇6月齡SD 大鼠進行造模觀察，這與國內(nèi)外絕大多數(shù)研究使用的大鼠的鼠齡是一致的[6]，美國食品與藥物管理局也建議研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型選擇6～10月齡雌鼠。

動情周期是反應激素水平變化的一個參考指標，去勢后最早出現(xiàn)變化。 本研究發(fā)現(xiàn)，卵巢切除術后，去勢組動情期逐漸縮短至消失，到術后第9周，去勢組失去規(guī)律的“動情前期-動情期-動情后期-動情間期”的變化，轉(zhuǎn)變?yōu)橐詣忧殚g期為主，動情前期和動情間期交替的改變， 提示去勢后大鼠體內(nèi)激素水平可能出現(xiàn)紊亂。

DXA 檢測BMD 是目前公認的診斷骨質(zhì)疏松癥的金標準，臨床上推薦的測量部位是腰椎1-4、總髖部和股骨頸。 根據(jù)BMD 計算T 值來判斷骨質(zhì)疏松程度：-2.5＜T≤-1.0 為低骨量，T≤-2.5 為骨質(zhì)疏松，BMD 每下降1個標準差骨折風險增加1.5～3.6 倍[7，8]。但是對于大鼠骨質(zhì)疏松的診斷尚不明確。 目前多數(shù)研究以與對照組相比，BMD 下降10%～20%為骨質(zhì)疏松模型建立成功[2，3]，且目前多數(shù)研究采用離體骨測量BMD，活體測量的案例較少。 本研究采取大鼠活體DXA 測量，發(fā)現(xiàn)相對于股骨， 腰椎的骨密度變化更為明顯。 在術后第6周，大鼠腰椎的骨密度即出現(xiàn)一定的降低，到術后第10 周即有明顯的下滑。 與對照組相比，去勢后大鼠的腰椎BMD 下降達20%以上，T 值亦＜-2.5；而股骨的骨密度變化較腰椎變化慢，BMD 僅降低11%。 股骨和椎骨骨密度變化的不均一可能是由于皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨對雌激素的敏感性不同[9，10]所致。 有研究[7，11]認為，BMD 變化速度，腰椎＞脛骨＞股骨＞脛骨上段＞股骨上段，這與本研究的結(jié)果是一致的。在研究骨質(zhì)疏松及治療效果時，以腰椎為研究對象更能敏感反映骨代謝變化和治療療效，腰椎BMD 下降20%可作為骨質(zhì)疏松模型建立成功的一個提示指標。

圖2 卵巢去勢對大鼠腰椎骨組織結(jié)構(gòu)的影響

骨重建是骨吸收和骨形成2個階段不斷循環(huán)往替的過程。 PINP 和OC 反映成骨細胞活力和骨形成，I-CTX 反映骨吸收情況，檢測血清骨代謝指標對判斷全身骨代謝水平有一定提示意義[12]。 本研究發(fā)現(xiàn)，卵巢去勢手術后3個月，大鼠血清OC、PINP 水平較對照組明顯降低，I-CTX 水平較對照組明顯升高， 提示卵巢切除后大鼠體內(nèi)骨吸收增多，而骨形成減少，有衍變?yōu)楣琴|(zhì)疏松的趨勢。 因此， 術后3個月可能是骨代謝指標降低的關鍵節(jié)點。但也有研究認為，術后8 周血清骨代謝指標即有改變，術后12 周變化更加突出[10，13]，與本研究結(jié)果存在差異， 這可能與實驗用鼠鼠齡和檢測方式不同有關。 本研究中去勢組OC 和I-CTX 水平均出現(xiàn)明顯變化且有統(tǒng)計學意義，PINP 水平較對照組有一定下降，但差異沒有統(tǒng)計學意義，這可能是由于血清骨轉(zhuǎn)換指標反映整體骨轉(zhuǎn)換水平， 出現(xiàn)變化略晚，而本研究觀察時間尚短，成骨細胞骨形成變化尚不明顯。由于大鼠血量較少，取血部位及血量有所限制， 血清骨轉(zhuǎn)化指標的代表性和準確性較DXA 差，故應作為骨質(zhì)疏松診斷的次要參考指標。

骨組織病理切片染色也是判斷骨質(zhì)疏松的重要手段，能夠清楚觀察骨小梁結(jié)構(gòu)變化。本研究于去勢手術后3個月取大鼠腰椎進行組織切片染色。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢去勢后，大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)塌陷，與對照組相比骨小梁變細，游離殘端增多，骨小梁內(nèi)少有膠原纖維及新生骨； 而對照組則保有完整的骨小梁結(jié)構(gòu)，少有游離殘端，骨小梁內(nèi)還可見到膠原纖維和新生骨， 這與國內(nèi)外研究結(jié)果是一致的[3，4，14]。 這表明卵巢切除手術可以促進骨質(zhì)的丟失進而形成骨質(zhì)疏松， 術后3個月腰椎即表現(xiàn)出明顯的骨質(zhì)量減低和骨小梁結(jié)構(gòu)塌陷。

卵巢摘除手術可以促進骨質(zhì)疏松的形成，是建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型的可靠辦法。 術后3個月是骨質(zhì)疏松模型建立成功的關鍵時點，骨密度、骨轉(zhuǎn)換指標和骨組織結(jié)構(gòu)在卵巢切除術后3個月均出現(xiàn)明顯的變化，表現(xiàn)出骨質(zhì)疏松。 DXA 檢測腰椎骨密度是早期篩查骨質(zhì)疏松的安全可靠的方法，術后10 周即可出現(xiàn)明顯的變化，腰椎BMD 下降20%可作為骨質(zhì)疏松模型建立成功的一個評價指標。血清骨轉(zhuǎn)換指標出現(xiàn)變化略晚，可作為骨質(zhì)疏松診斷的次要參考指標。 絕經(jīng)后卵巢功能的降低和激素水平紊亂可能是骨質(zhì)疏松形成的重要原因， 但卵巢調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)化水平的具體機制及如何通過改善或者重建卵巢功能進而治療骨質(zhì)疏松，仍需進一步深入研究。